论文摘要
第一章腹脂素对内皮细胞ICAM-1表达的影响背景腹脂素是一种新发现的脂肪细胞因子,在肥胖、糖尿病以及高血压患者体内有显著升高。体外实验发现腹脂素能促进单核细胞、脂肪细胞等多种细胞分泌TNF-a、IL-1β和IL-6等炎症因子;腹脂素也能促进单核细胞表达ICAM-1和促进内皮细胞表达VEGF。而脂肪细胞和单核细胞也能分泌表达腹脂素。腹脂素在颈动脉粥样硬化斑块和冠脉斑块上表达丰富,且有缺血性症状者的腹脂素水平高于无症状者,这些提示腹脂素很可能和动脉粥样硬化病变发展有关。腹脂素能通过激活内皮ERK（1/2）信号途径促进细胞表达VEGF,而既往有研究发现激活内皮细胞ERK（1/2）能促进粘附分子ICAM-1的表达。内皮细胞ICAM-1表达增加会促进单核细胞粘附于内皮加速动脉粥样硬化进展。我们推测腹脂素可能通过激活内皮细胞的ERK（1/2）信号通路促进粘附分子ICAM-1的表达而影响动脉粥样硬化病变的进展。目的观察腹脂素单独或者协同ox-LDL、葡萄糖对内皮细胞表达ICAM-1以及对内皮-单核细胞粘附的影响。方法采用HUVEC内皮细胞株传代3-6代时处于对数生长期的细胞作为研究对象。观察细胞:（1）腹脂素（100ng/ml～800ng/ml）干预内皮细胞24小时或者ERK（1/2）抑制剂PD98059预先干预细胞30分钟后再予腹脂素干预细胞24小时,细胞ICAM-1和ERK（1/2）表达的变化;（2）腹脂素（100ng/ml～800ng╱ml）和ox-LDL（40ug╱ml）协同刺激内皮细胞24小时或者ERK1/2抑制剂PD98059预先干预细胞30分钟后再予腹脂素和ox-LDL协同刺激细胞24小时,细胞ICAM-1和ERK1/2表达的变化;（3）腹脂素（100ng╱ml～800ng/ml）和葡萄糖（30mmol╱l）协同刺激内皮细胞24小时或者ERK1/2抑制剂PD98059预先干预细胞30分钟后再予腹脂素和葡萄糖协同刺激细胞24小时,观察细胞ICAM-1和ERK1/2的表达变化;（4）上述腹脂素不同干预对单核细胞和内皮细胞粘附的影响。通过检测细胞ICAM-1mRNA和蛋白表达变化来观察腹脂素、腹脂素+ox-LDL或者腹脂素+葡萄糖对内皮细胞ICAM-1表达的影响,以及ERK1/2信号途径在腹脂素影响内皮细胞表达ICAM-1中的作用。结果1.腹脂素能促进内皮细胞表达ICAM-1,且其水平越高（观察浓度100ng╱ml～800ng/ml）,刺激内皮细胞表达ICAM-1的作用越强,腹脂素也促进了细胞ERK1/2的表达,ERK1/2抑制剂PD98059能显著抑制ICAM-1的表达2.腹脂素和ox-LDL有协同刺激内皮细胞表达ICAM-1的作用,且腹脂素水平越高（观察浓度100ng╱ml～800ng/ml）,协同刺激内皮细胞表达ICAM-1的作用越强,腹脂素和ox-LDL也促进了细胞ERK1/2的表达,ERK1/2抑制剂PD98059能显著抑制ICAM-1的表达。3.腹脂素和葡萄糖有协同刺激内皮细胞表达ICAM-1的作用,且腹脂素水平越高（观察浓度100ng╱ml～800ng/ml）,协同刺激内皮细胞表达ICAM-1的作用越强,腹脂素和高糖也促进了细胞ERK1/2的表达,ERK1/2抑制剂PD98059能显著抑制ICAM-1的表达。4.腹脂素促进内皮细胞表达ICAM-1的同时,也增强了单核细胞和内皮细胞的粘附能力。结论腹脂素有促进内皮细胞表达ICAM-1的作用,在ox-LDL或者葡萄糖促进内皮细胞表达ICAM-1的基础上腹脂素能进一步促进ICAM-1表达,腹脂素促进内皮细胞表达ICAM-1和其激活细胞ERK1╱2信号通路有关。腹脂素促进细胞ICAM-1表达增加的同时也促进了单核细胞和内皮细胞的粘附。第二章腹脂素对单核细胞MCP-1表达的影响背景在动脉粥样硬化病变的发展过程中,单核细胞表达MCP-1增加及随后的单核细胞向内皮下趋化迁移增多是促进动脉粥样硬化发展的重要因素。腹脂素是一种新发现的脂肪细胞因子,在和动脉粥样硬化病变密切相关的肥胖、糖尿病以及高血压患者体内有显著升高。已有研究发现腹脂素有促进单核细胞表达ICAM-1、内皮细胞表达VEGF的作用。腹脂素在颈动脉动脉粥样硬化斑块和冠脉斑块上有显著表达,且有症状的颈动脉粥样硬化患者腹脂素水平显著高于无症状者,这些提示腹脂素很可能和动脉粥样硬化病变发展有关。单核细胞MCP-1的表达能促进粘附于内皮细胞上的单核细胞向内皮下趋化迁移,腹脂素对单核细胞趋化因子MCP-1表达的影响尚无研究。目的观察腹脂素单独或者协同ox-LDL、葡萄糖对单核细胞表达MCP-1的影响,以及p38MAPK信号通道在腹脂素影响MCP-1表达中的作用。方法采用THP-1单核细胞株传代3-6代时处于对数生长期的细胞作为研究对象。观察细胞:（1）腹脂素（100ng╱ml～800ng╱ml）干预单核细胞24小时或者p38抑制剂SB202190预先干预细胞30分钟后再予腹脂素干预细胞24小时,细胞MCP-1表达的变化;（2）腹脂素（100ng/ml～800ng╱ml）和ox-LDL（40ug╱ml）协同刺激单核细胞24小时或者p38抑制剂SB202190预先干预细胞30分钟后再予腹脂素和ox-LDL协同刺激细胞24小时,细胞MCP-1表达的变化;（3）腹脂素（100ng╱ml～800ng╱ml）和葡萄糖（30mmol/l）协同刺激单核细胞24小时或者p38抑制剂SB202190预先干预细胞30分钟后再予腹脂素和葡萄糖协同刺激细胞24小时,细胞MCP-1表达的变化。通过检测细胞MCP-1mRNA和蛋白来观察腹脂素、腹脂素+ox-LDL或者腹脂素+葡萄糖对单核细胞MCP-1表达的影响,以及p38 MAPK信号途径在腹脂素影响单核细胞表达MCP-1中的作用。结果1.腹脂素能促进单核细胞表达MCP-1,且其水平越高（观察浓度100ng/ml～800ng╱ml）,刺激单核细胞表达MCP-1的作用越强,p38抑制剂SB202190能显著抑制腹脂素促进单核细胞表达MCP-1的作用。2.腹脂素+ox-LDL有协同刺激单核细胞表达MCP-1的作用,腹脂素水平越高,其协同刺激单核细胞表达MCP-1的作用越强,p38抑制剂SB202190能显著抑制腹脂素促进单核细胞表达MCP-1的作用。3.腹脂素+葡萄糖有协同刺激单核细胞表达MCP-1的作用,腹脂素水平越高,其协同刺激单核细胞表达MCP-1的作用越强,p38抑制剂SB202190能显著抑制腹脂素促进单核细胞表达MCP-1的作用。结论腹脂素有促进单核细胞表达MCP-1的作用,在ox-LDL或者葡萄糖促进单核细胞表达MCP-1的基础上腹脂素能进一步促进MCP-1表达,腹脂素促进单核细胞表达MCP-1和其激活细胞p38MAPK信号通路有关。第三章腹脂素对THP-1巨噬细胞CD36表达的影响背景j动脉粥样硬化病变的发展过程中,迁移到内皮下的单核细胞转化为巨噬细胞后其表面清道夫受体CD36表达增加并促进细胞摄取ox-LDL和高级糖基化终末产物,从而促进巨噬细胞转变为泡沫细胞,加速动脉粥样硬化的进展。在巨噬细胞CD36表达的过程中PPARγ信号途径激活起着重要作用。腹脂素在颈动脉斑块和冠脉斑块上表达丰富,且有脑缺血症状的颈动脉粥样硬化患者腹脂素水平显著高于无症状者,提示腹脂素很可能和动脉粥样硬化病变的发展有关。腹脂素是否通过改变单核-巨噬细胞清道夫受体CD36的表达影响动脉粥样硬化病变进展尚不清楚。目的观察腹脂素单独或者协同ox-LDL、葡萄糖对单核-巨噬细胞表达清道夫受体CD36表达和细胞对胆固醇摄取的影响。方法将处于对数生长期的THP-1单核细胞予佛波酯诱导分化为巨噬细胞后作为研究对象。观察:（1）腹脂素（100ng╱ml～800ng╱ml）干预巨噬细胞24小时或者PPARγ抑制剂GW9662预先干预细胞30分钟后再予腹脂素干预细胞24小时,细胞CD36的表达变化;（2）腹脂素（100ng/ml～800ng╱ml）和ox-LDL（40ug╱ml）协同刺激巨噬细胞24小时或者PPARγ抑制剂GW9662预先干预细胞30分钟后再予腹脂素和ox-LDL协同刺激细胞24小时,细胞的CD36表达和细胞吞噬脂质的变化;（3）腹脂素（100ng/ml～800ng╱ml）和葡萄糖（30mmol/l）协同刺激巨噬细胞24小时或者PPARγ抑制剂GW9662预先干预细胞30分钟后再予腹脂素和高糖协同刺激细胞24小时,细胞的CD36表达变化;（4）腹脂素或者腹脂素协同ox-LDL、葡萄糖对THP-1巨噬细胞PPARγmRNA表达的影响。通过RT-PCR法检测细胞CD36和PPARγmRNA的表达水平,用western-blotting法检测细胞CD36蛋白水平,从核酸和蛋白的水平来观察腹脂素、腹脂素+ox-LDL或者腹脂素+葡萄糖对巨噬细胞CD36表达的影响,以及PPARγ信号途径在腹脂素影响巨噬细胞表达CD36中的作用。结果1.腹脂素能促进THP-1巨噬细胞表达CD36和PPARγ,且其水平越高（观察浓度100ng/ml～800ng╱ml）,刺激THP-1巨噬细胞表达CD36和PPARγ的作用越强,PPARγ抑制剂GW9662能显著抑制腹脂素促进THP-1巨噬细胞表达CD36的作用。2.腹脂素+ox-LDL有协同刺激THP-1巨噬细胞表达CD36和PPARγ的作用,腹脂素水平越高,其协同刺激THP-1巨噬细胞表达CD36和PPARγ的作用越强,细胞吞噬的脂质量越多,THP-1巨噬细胞泡沫化现象越显著,PPARγ抑制剂GW9662能显著抑制腹脂素和ox-LDL促进THP-1巨噬细胞表达CD36和吞噬脂质的作用。3.腹脂素+葡萄糖有协同刺激THP-1巨噬细胞表达CD36和PPARγ的作用,腹脂素水平越高,其协同刺激THP-1巨噬细胞表达CD36和PPARγ的作用越强,PPARγ抑制剂GW9662能显著抑制腹脂素和高糖促进THP-1巨噬细胞表达CD36的作用。结论腹脂素有促进巨噬细胞表达CD36的作用,在ox-LDL或者葡萄糖促进巨噬细胞细胞表达CD36的基础上腹脂素能进一步促进CD36表达,腹脂素促进巨噬细胞细胞表达CD36和其激活细胞PPARγ信号通路有关。CD36表达增加的同时伴有细胞摄取脂质的增加
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