基于基因打靶的绿色荧光丝转基因家蚕研究

论文摘要

家蚕（Bombyx mori）属于鳞翅目蚕蛾科,能大规模饲养,遗传背景比较清楚,其丝腺具有强大合成和分泌丝蛋白的能力。为了探索从分子改良上对家蚕进行遗传改造,本研究利用家蚕丝素轻链基因终止密码子TAA上游约1.2 kb片段和TAA下游约0.5 kb片段作为基因打靶的左右同源臂,将缺少启动子驱动的绿色荧光蛋白基因（ gfp ）插入到两同源臂的中间,构建获得基因打靶载体pSK-FibL-L-GFP-FibL-R。然后将该载体转染BmN细胞,通过绿色荧光检测,证明载体构建有效。通过精子介导法将该载体导入家蚕卵,首先在G0代通过绿色荧光筛选荧光蚕,由PCR结果证实所筛选出的荧光蚕为转基因家蚕;western blot检测结果显示,在G3代后部丝腺组织中可检测到分子量为70 kDa的GFP-Fib.L融合表达蛋白的特异性条带。研究结果表明通过基因打靶将外源基因导入了家蚕丝素轻链基因中,并成功实现融合表达。同时,本研究利用家蚕丝素轻链序列的第57外显子片段（约1.2 kb）和第7外显子及其侧翼序列片段（约0.5 kb）作为基因打靶的左右同源臂,将gfp基因和人工合成的家蚕抗菌肽基因（cec）融合克隆到两同源臂之间,并从设计上将gfp-cec基因融合到丝素轻链基因;将由ie-1驱动的DsRed基因表达盒克隆在右侧同源臂的外面,作为负选择标记,构建了在结构与功能上与上述不同的另一个基因打靶转基因载体pSK-Fib.L-L-GFP-cec-Fib.L-R-IE-DsRed-PolyA。将该载体转染细胞进行功能验证,发现转基因细胞中存在只有绿色荧光而无红色荧光的细胞,表明载体构建成功;再将该载体用精子介导转入家蚕卵,对呈绿色荧光的个体进行鉴定。初步获得了能产生绿色荧光抗菌丝的转基因家蚕。研究为探索通过分子改良,对家蚕进行遗传育种提供了新的思路。研究过程中,通过RT-PCR方法获得了家蚕JAK/STAT途径中的信号传导抑制因子（suppressor of cytokine signaling,SOCS）2的cDNA基因（BmSOCS-2A）,测序结果表明,该792 bp片段含有完整的ORF,由4个外显子组成,编码263个氨基酸残基,分子量为28.8 kD。结构分析显示BmSOCS-2A有5个α螺旋结构,存在典型的SH2结构域和SOCS结构域。基因芯片数据分析结果显示,BmSOCS-2在家蚕雌雄性腺组织中表达量最高。进化分析表明,SOCS以不同种类聚类在一起,表明各种SOCS基因在各昆虫物种形成前就已产生SOCS基因家族。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 文献综述
• 第一章 基因打靶技术的研究进展
• 1 基因打靶技术的发展
• 1.1 基因打靶概述
• 1.2 基因打靶的操作
• 2 基因打靶家蚕研究的现状
• 3 展望
• 3.1 基于重组酶介导的位点特异性基因打靶
• 3.2 基于锌指蛋白核酸酶技术的基因打靶
• 参考文献
• 第二章 抗菌肽的研究进展
• 1 抗菌肽的抗菌机制
• 2 抗菌肽的生物学活性
• 2.1 抗菌肽的广谱抗菌活性
• 2.2 抗菌肽具有抗肿瘤的作用
• 2.3 抗菌肽具有促进伤口愈合的作用
• 2.4 抗菌肽具有抗病毒的作用
• 3 抗菌肽应用前景
• 3.1 抗菌肽作为饲料添加剂
• 3.2 抗菌肽作为药物载体
• 3.3 抗菌肽可作为新型抗生药物
• 3.4 抗菌肽作为食品防腐剂
• 3.5 抗菌肽可对畜禽疾病的治疗与预防作用
• 3.6 抗菌肽的转基因研究
• 4 家蚕抗菌肽基因研究进展
• 4.1 家蚕抗菌肽基因的研究
• 4.2 已获得的家蚕抗菌肽基因
• 4.3 家蚕抗菌肽基因研究的前景
• 参考文献
• 第二部分 研究报告
• 第三章 研究目的与内容
• 1 研究目的及意义
• 2 研究策略与内容
• 2.1 轻链蛋白融合绿色荧光蛋白的基因打靶转基因家蚕研究
• 2.2 轻链蛋白融合绿色荧光蛋白及抗菌肽的基因打靶转基因家蚕研究
• 3 技术路线
• 第四章 实验材料与方法
• 1 实验材料
• 1.1 培养基
• 1.2 常用溶液及缓冲液
• 1.3 SDS-PAGE 试剂
• 1.4 Western blot 试剂
• 1.5 生物材料
• 1.6 工具酶、试剂盒、杂交膜
• 2 常用仪器
• 3 实验方法
• 3.1 碱裂解法少量制备质粒DNA
• 3.2 限制性内切酶反应
• 3.3 连接反应
• 2 法制备E.coli 感受态细胞'>3.4 CaCl₂ 法制备E.coli 感受态细胞
• 3.5 重组DNA 的转化
• 3.6 家蚕细胞培养
• 3.7 蚕蛾（蚕血）基因组的抽提
• 3.8 PCR 扩增目的片段
• 3.9 家蚕后部丝腺蛋白质的提取
• 3.10 RT-PCR
• 3.11 SDS-PAGE 电泳和Western blot
• 3.12 缫丝
• 参考文献
• 第五章 Fib-L 融合GFP 的基因打靶
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 PCR 引物
• 2.3 打靶载体pSK-FibL-L-GFP–FibL-R 的构建
• 2.4 转基因载体转染BmN 细胞
• 2.5 用精子介导法将转基因载体导入家蚕卵
• 2.6 转基因家蚕的筛选
• 2.7 转基因蚕的PCR 和RT-PCR 鉴定
• 2.8 转基因家蚕丝腺表达蛋白的Western blot 检测
• 2.9 缫丝
• 3 结果与分析
• 3.1 转基因载体的鉴定
• 3.2 转基因载体的转家蚕BmN 细胞
• 3.3 转基因家蚕的筛选
• 3.4 转基因家蚕的分子鉴定
• 3.5 转基因蚕茧经缫丝后的荧光鉴定
• 4 讨论
• 参考文献
• 第六章 Fib-L 融合GFP 及抗菌肽的转基因家蚕
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 引物及PCR 扩增
• 2.3 打靶载体的构建
• 2.4 用精子介导法将打靶载体导入家蚕卵
• 3 结果与分析
• 3.1 打靶载体的构建
• 3.2 基因打靶载体的转基因细胞研究
• 3.3 融合GFP 与家蚕抗菌肽基因的转基因家蚕的获得
• 3.4 转基因家蚕的荧光及分子生物学鉴定
• 4 讨论
• 参考文献
• 第七章 家蚕SOCS-2 基因的克隆与序列分析
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 BmSOCS-2 基因的克隆及组织表达
• 2.3 BmSOCS 基因的生物信息学分析
• 3 结果与分析
• 3.1 家蚕SOCS 基因的电子克隆及RT-PCR
• 3.2 BmSOCS-2 基因及其编码氨基酸的结构域分析
• 3.3 BmSOCS-2 基因的同源性比较
• 3.4 BmSOCS-2 基因的表达谱分析
• 3.5 分子进化树分析
• 4 讨论
• 参考文献
• 结论
• 1 已取得的成果
• 2 有待进行的研究
• 附录一 缩略词中英文对照表
• 附录二 实验中使用的部分载体结构图
• 附录三 攻硕期间科研情况
• 1 研究课题
• 2 发表论文
• 致谢