胡宁病毒核蛋白结构与功能的研究

论文摘要

胡宁病毒被认为是致命的阿根廷出血热的病原体。该种疾病严重威胁公众健康安全,并导致超过五百万人陷于疾病威胁之中。由于其传播途径为依靠飞沫传播,故被认为是一种潜在的生化武器而更加受到各方重视。胡宁病毒是一种负义单链RNA病毒,隶属于沙粒病毒科沙粒病毒属。其基因组由两段组成,合成四种蛋白质。在这四种蛋白质中,核蛋白在病毒RNA合成以及针对宿主的免疫抑制等方面均发挥重要作用。但人们对其具体的分子作用机制知之甚少。迄今为止,已有多种负链RNA病毒的核蛋白结构得到解析,但就沙粒病毒科而言,却只有拉沙热病毒的核蛋白已经解析结构。在本论文中,我们解析了沙粒病毒科另一种重要病毒——胡宁病毒的核蛋白C端结构域的结构,其分辨率达到2.2A。这一结构与拉沙热病毒核蛋白的C端结构域有许多相似之处,却也包含不同之处。该研究拓展了我们对负义单链RNA病毒核蛋白的认识。2003年,严重急性呼吸系统综合征的爆发对世界各国均造成了巨大危害。其病原体被认定为是冠状病毒的一种：SARS冠状病毒。该病毒基因组可产生十六种非结构蛋白质,用于病毒的复制与转录工作。其中,非结构蛋白8被认为是该病毒的引物酶。它为该病毒的RNA依赖的RNA聚合酶(非结构蛋白12)生产并提供引物。它同时也是该病毒的第二种RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)。SARS冠状病毒的非结构蛋白7与非结构蛋白8可以形成一个十六聚体的超级复合物。其结构不同于普通RNA依赖的RNA聚合酶的结构,暗示其独特的工作机制。在本论文中,我们解析了非结构蛋白7与非结构蛋白8C端结构域的复合物结构,并依据体内实验证据和结构信息,提出了在非结构蛋白8C端结构域参与调节下的冠状病毒引物酶超级复合物工作机制的模型,该模型为抗冠状病毒药物的研制提供了依据,进而为控制并遏制致命的SARS冠状病毒及其类似物的传播提供帮助。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 主要符号说明
• 第一章 引言
• 第一节 沙粒病毒研究现状概述
• 1.1.1 选题背景及意义
• 1.1.2 沙粒病毒科研究概况
• 1.1.2.1 沙粒病毒简介与分类
• 1.1.2.2 沙粒病毒生活周期
• 1.1.2.3 沙粒病毒引发的疾病
• 1.1.3 胡宁病毒研究概况
• 1.1.3.1 胡宁病毒分布、研究概况
• 1.1.3.2 胡宁病毒病毒结构和基因组构成
• 1.1.3.3 NP在胡宁病毒生活周期中的重要作用
• 1.1.4 单股负链RNA（-ssRNA）病毒NP的结构与功能研究概况
• 1.1.4.1 单节段-ssRNA病毒（the order Mononegavirales）NP结构与功能研究概况
• 1.1.4.2 多节段-ssRNA病毒NP结构与功能研究概况
• 1.1.5 本部分的课题内容与意义
• 第二节 冠状病毒研究现状概述
• 1.2.1 选题背景及意义
• 1.2.2 冠状病毒科研究概况
• 1.2.2.1 冠状病毒的简介与分类
• 1.2.2.2 冠状病毒的生活周期
• 1.2.2.3 冠状病毒引发的疾病
• 1.2.3 SARS病毒研究概况
• 1.2.3.1 SARS病毒研究概况
• 1.2.3.2 SARS病毒病毒结构和基因组组成
• 1.2.4 冠状病毒科蛋白质结构与功能研究概况
• 1.2.4.1 非结构蛋白结构与功能研究
• 1.2.4.2 结构蛋白结构与功能研究
• 1.2.4.3 附属蛋白的研究
• 1.2.5 本部分的课题内容与意义
• 第三节 文章结构安排
• 第二章 胡宁病毒核蛋白NP表达、纯化与结构解析
• 第一节 胡宁病毒NP生物信息学分析及预测
• 2.1.1 核苷酸序列分析
• 2.1.2 蛋白质序列基本信息
• 2.1.3 蛋白质序列其他分析
• 2.1.4 蛋白质同源序列比对
• 第二节 胡宁病毒NP的基因克隆与融合蛋白的构建
• 第三节 胡宁病毒NP的蛋白质表达与纯化
• 2.3.1 融合蛋白试表达
• 2.3.2 融合蛋白大量表达
• 2.3.3 融合蛋白的纯化
• 2.3.3.1 细胞的破碎
• 2.3.3.2 GST亲和层析
• 2.3.3.3 离子交换层析
• 第四节 胡宁病毒NP△340的蛋白质结晶与数据收集
• 2.4.1 蛋白质的结晶
• 2.4.1.1 蛋白质结晶原理
• 2.4.1.2 胡宁病毒NP△340蛋白质晶体的初步筛选
• 2.4.1.3 胡宁病毒NP△340蛋白质晶体的优化
• 2.4.2 数据的收集
• 第五节 胡宁病毒NP△340的蛋白质晶体数据相位的确定与结构修正
• 2.5.1 解决蛋白质晶体数据相位的方法
• 2.5.2 胡宁病毒NP△340相位的确定与精修
• 2.5.3 最终结构模型的质量评估
• 第三章 胡宁病毒NP△340的三维结构分析
• 第一节 胡宁病毒NP△340的总体结构的描述
• 第二节 胡宁病毒NP△340与拉沙热病毒NP的结构比较
• 第三节 胡宁病毒NP△340结构中金属离子的存在情况
• 第四节 胡宁病毒NP△340功能分析
• 3.4.1 溶液状态下的胡宁病毒NP△340结合二价金属离子情况
• 3.4.2 胡宁病毒NP△340的3’-5’核酸外切酶活性测定
• 第四章 SARS冠状病毒非结构蛋白7与非结构蛋白8 C端结构域的复合物
• 第一节 非结构蛋白8的C端结构域的证实
• 第二节 非结构蛋白8的C端结构域的克隆构建
• 第三节 非结构蛋白7与8的C端结构域的蛋白质共纯化
• 4.3.1 非结构蛋白7与8C的大量表达
• 4.3.2 非结构蛋白7与8C的菌体破碎
• 4.3.3 亲和层析
• 4.3.4 凝胶排阻层析
• 第四节 非结构蛋白7与8的C端结构域复合物的结构解析与分析
• 4.4.1 复合物的结晶
• 4.4.2 复合物的数据收集与处理
• 4.4.3 非结构蛋白7-8C复合物结构分析
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录A 胡宁病毒核蛋白核苷酸序列与氨基酸序列
• 附录B 非结构蛋白7与非结构蛋白8相关核苷酸序列与氨基酸序列
• 个人简历在学期间发表的学术论文与研究成果