大鼠三肽基肽酶Ⅰ在体外对血管紧张素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ水解作用的研究

论文摘要

目的为进一步探讨大鼠三肽基肽酶Ⅰ（ Tripeptidyl peptidase I,TPP I）的生物学活性,特别是对具有生物学活性的小分子肽的降解作用机制的研究,我们用高效液相层析及飞行质谱仪,在体外分析了大鼠TPPⅠ对血管紧张素I、II、III等小分子肽的水解作用。方法先将纯化的大鼠TPP I与血管紧张素I、II、III、Leu-enkepha lin、Bradykinin等小分子肽及合成基质Ala-Ala-Phe-MAC混合,37℃水浴,在不同的水解时间,观察TPP I对上述小分子肽的水解。将消化后的水解混合物分别用0.22μm的滤膜抽滤后,分别取滤液50μl加样到逆相高效液相层析柱上,肾素-血管紧张素I、II用0.01%TFA /乙腈浓度由0至50%连续递增洗脱;肾素-血管紧张素III、Leu-enkephalin、Bradykinin用0.01%TFA /乙腈浓度由0至100%连续递增洗脱,在A215nm波长处,收集每一个峰。于飞行质谱仪检测板上,每检测点滴加0.5μl Matrix和2μl的每一个峰的收集液,混匀,自然晾干。全部待检样品完全干燥后上机分析。获得TPPI切割血管紧张素I、II、III和Leu-enkephalin、Bradykinin的各肽段的分子量图谱,另外用荧光分光光度计在Ex:380nm,Em:440nm的条件下,测定合成基质Ala-Ala-Phe-MCA释放出AMC的荧光强度,通过标准曲1、TPPI对Ang I的水解发生在DRV↓YIHPFHL,释放出三肽DRV和七肽YIHPEHL两个水解片段。TPPI对Ang II的水解发生在DRV和YIHPF之间,释放出三肽DRV和五肽YIHPF两个水解片段。TPPI对Ang III的水解发生在RVY和IHPF之间,释放出三肽RVY和四肽IHPF两个水解片段线法计算酶对该基质的水解速度。结果通过时相实验证明了,随着酶解时间的延长,Ang I、II、III的含量逐渐减少。16h时,Ang I的水解速率为11.3%;16h时,Ang II的水解速率为18.2% ;15min时,Ang III的水解速率为95%, 30min时,Ang III完全消失。而24h后Leu-enkephalin、Bradykinin仍无水解迹象。2、利用AMC的浓度对荧光强度的标准曲线,查找TPP I对Ala-Ala-Phe-MCA的水解速率的大小,表明,在60 min时,TPP I对Ala-Ala-Phe-MCA的水解速率为33.8%。结论1、TPP I可不同程度地水解Ang I、II、III,对Leu-enkephalin、Bradykinin没有水解作用。TPP I对Ang III的水解作用最强大,并且远远大于水解Ala-Ala-Phe-MCA的速度。即水解速度的大小顺序为:Ang III >> Ala-Ala-Phe-MCA〉Ang II>Ang I。2、血管紧张素III是TPP I的天然基质。

论文目录

• 内容提要
• 第一章 前言
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 第三章 结果
• 3.1 TPP I 对血管紧张素 I、 II、III 及 Leu-enkephalin、Bradykinin 的水解作用
• 3.2 测定分解片段的氨基酸顺序
• 3.3 对合成基质Ala-Ala-Phe-MCA 的水解作用的分析
• 第四章 讨论
• 4.1 血管升压素的释放
• 4.2 血压调节
• 结论
• 参考文献
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 致谢
• 英文缩略语表