柴胡皂苷a对IL-1β激活大鼠海马星形胶质细胞的干预及机制研究

论文摘要

一、目的与意义癫痫是一组反复发作的神经元异常放电所致的短暂性中枢神经系统功能失常的慢性疾病。我国流行病学调查表明癫痫的患病率为4.6‰,估计已有癫痫病人约455万～630万人。传统抗癫痫药如苯妥英钠、丙戊酸钠、卡马西平、乙琥胺等一直是治疗癫痫的主要药物,但药代动力学的局限性,致畸的可能性,对骨密度的影响,以及对认知功能产生的不良作用而导致癫痫患者生活质量下降等因素,限制了其应用。大约30%癫痫病人对各种疗法包括药物、癫痫手术、迷走神经刺激等耐受,这就需要研发新的抗癫痫药物。中药可通过调节神经递质、调控离子通道、抑制神经胶质细胞增生、清除自由基等实现抗癫痫作用,而单味中药的活性成分研究不但能明确抗癫痫机制,还有利于促进中医药的现代化。细胞因子可调节神经元的功能与代谢,IL-1β能够通过两种途径增强谷氨酸介导的神经元兴奋性:增强细胞外谷氨酸浓度,增强NMDA受体功能。IL-1β通过激活NF-κB和MAPK依赖性的基因引起长期效应,包括神经胶质和神经网络的结构和功能改变。星形胶质细胞可参与神经活动的主动控制和神经突触传递过程。癫痫发作激活星形胶质细胞,引起反应性胶质增生,表现为细胞增殖、肥大,一些骨架蛋白如星形胶质细胞特异性表达的胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidicprotein,GFAP）及星形胶质共同标记—波形蛋白（vimentin）表达上调。体外研究证实MAPK介导细胞因子对星形胶质细胞的诱导。JNK/SAPK信号通路可被细胞因子（IL-1、TNF-a）、应激刺激（如紫外线、热休克、高渗刺激等）、生长因子（EGF）及某些G蛋白偶联的受体激活。柴胡皂苷a（SSa）为我国传统中药柴胡中主要药理成分柴胡皂苷的一种单体成分,我们前期的研究发现柴胡总皂苷和SSa可以抗实验性癫痫、抑制慢性点燃大鼠GFAP的表达;影响戊四氮点燃大鼠海马CA1区的Glu表达水平。本研究观察了SSa对炎性因子IL-1β激活的体外培养大鼠海马星形胶质细胞的干预及其机制研究。二、方法与内容1.大鼠海马星形胶质细胞的培养与鉴定星形胶质细胞的原代培养参考McCarthy法加以改进。取新生SD大鼠海马,剪碎,消化,离心,差速贴壁40 min后,按106个/ml接种。37.0℃,5%CO2孵箱中培养7-9 d,待培养的细胞70%-80%融合时,将培养瓶置于恒温旋转摇床上摇18 h（37.0℃,240 r/min）后,进行传代培养即得纯化的星形胶质细胞,纯化的细胞进一步运用免疫细胞化学SABC法进行鉴定。2.SSa对IL-1β激活的大鼠海马星形胶质细胞活性的影响2.1活细胞数目与OD值线性检验:纯化的细胞经台盼蓝染色计数,用15%完全培养基按8×104个/ml的密度传代,分别取10μl、25μl、50μl、75μl、150μl接种于96孔培养板中,每孔以完全培养基补至200μl,每个剂量设4个复孔。继续培养72 h后,MTT测OD值。2.2实验用细胞传代按7×104个/ml的密度用15%完全培养基接种于96孔培养板中,每孔种植200μl。继续培养48 h后,细胞随机（随机方法参照文献）分为5组:对照组（control）,IL-1β15 ng/ml的激活组,IL-1β15 ng/ml+SSa剂量组（分别为2,1,0.5 mg/L）,每组设6孔。用含5%胎牛血清的培养基配制不同药物,每孔加入200μl,干预72 h后,MTT法测OD值。3.SSa对IL-1β激活的大鼠海马星形胶质细胞分裂周期的影响运用流式细胞技术检测各组星形胶质细胞的细胞周期。将传代细胞以5×105个/ml密度种植于75 cm2的培养瓶中。完全培养基培养48 h后,DMEM/F12无血清养培养基血清剥夺24 h,细胞随机分为4组:对照组（control）,IL-1β15 ng/ml的激活组,IL-1β15 ng/ml+SSa不同剂量组（SSa分别为1,0.5 mg/L）。用DMEM/F12无血清培养基配制不同药物,加药刺激24 h后终止作用,细胞用预冷的70%乙醇固定,PI染色并调整细胞密度为106个/ml,流式细胞技术检测各组星形胶质细胞细胞周期,每组样本检测104个细胞,以细胞指数表示分布于细胞周期各时相的细胞百分比数,以增殖指数反映细胞增殖状态。4.SSa对IL-1β激活的大鼠海马星形胶质细胞GFAP、vimentin、p-JNK、NF-κB表达的影响运用Western-blot法分别检测各组星形胶质细胞GFAP、vimentin、p-JNK、NF-κB表达量。传代细胞以5×105个/ml的密度种植于6孔培养板,培养48 h后,DMEM/F12无血清养培养基血清剥夺24 h后,将细胞随机分为4组:对照组（control）,IL-1β15 ng/ml的激活组,IL-1β15 ng/ml+SSa不同剂量组（SSa分别为1,0.5 mg/L）。用DMEM/F12无血清培养基配制不同药物,加药刺激24 h后终止作用,全蛋白提取试剂盒提取蛋白,考马斯亮蓝法蛋白定量以确定上样量,运用Western-blot技术检测GFAP、vimentin、p-JNK、NF-κB表达的变化,对结果进行光密度分析,计算不同蛋白与β-actin的比值。每组蛋白检测6次。5.统计方法应用SPSS 13.0统计软件进行处理。计量数据以（?）±S表示,各组MTT比色法结果和western-blot检测结果比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）,多重比较用LSD法;活细胞数目与OD值线性检验采用Curve Estimation;流式细胞术检测结果比较采用卡方检验,P＜0.05表示差异具有统计学意义。三、结果1.大鼠海马星形胶质细胞的原代培养和鉴定原代培养的大鼠海马星形胶质细胞,镜下观察可见星形胶质细胞生长较好,所有细胞均贴壁,可见光晕,胞突明显,细胞向外伸出长短不一的突起,细胞质中可见一清晰的卵圆形的细胞核,胞质丰富。原代培养的星形胶质细胞运用免疫细胞化学染色法鉴定,细胞GFAP免疫反应阳性率为95%以上。2.SSa对IL-1β激活的大鼠海马星形胶质细胞活性的影响经Curve Estimation统计分析,活细胞数目与MTT法所测OD值成线性,RSquare=0.997,P＜0.001。SSa对IL-1β激活的大鼠海马星形胶质细胞活性的影响:含IL-1β（15 ng/ml）的激活组的OD值高于对照组且有显著性差异（P＜0.01）,说明IL-1β对星形胶质细胞具有促增殖的激活作用。SSa各剂量组OD值均低于激活组,差异有统计学意义,说明SSa可抑制IL-1β激活下星形胶质细胞的异常增殖。SSa 2 mg/L组OD值显著性低于对照组（P＜0.01）,SSa 0.5 mg/L组显著性高于对照组（P＜0.01）,而SSa 1 mg/L组和对照组无统计学差异（P=0.058）。3.SSa对IL-1β激活的大鼠海马星形胶质细胞分裂周期的影响各组流式细胞结果显示:各组细胞的增殖指数有显著性差异（P＜0.01）,IL-1β激活组的增殖指数较control组高,说明IL-1β对星形胶质细胞具有促增殖的激活作用。SSa各剂量组增殖指数均低于激活组,说明各剂量组对激活的细胞的分裂周期均有一定的阻滞作用。其中SSa 1 mg/L的增殖指数较其他组低与对照组最接近,说明此剂量组对激活胶质细胞分裂周期的阻滞作用较其他组强。4.SSa对IL-1β激活的大鼠海马星形胶质细胞GFAP表达的影响Western blot条带光密度分析显示含IL-1β15 ng/ml的激活组的GFAP光密度值较对照组增加1.5倍,且有显著性差异（P＜0.01）,说明IL-1β激活的星形胶质细胞特异性蛋白GFAP表达量显著增加。SSa各组的光密度值较激活组显著降低（P＜0.01）,SSa 1,0.5 mg/L可使星形胶质细胞GFAP表达分别下降34.7%和53.2%。SSa 1 mg/L给药组光密度值与对照组比较,差异无统计学意义（P=0.126）。5.SSa对IL-1β激活的大鼠海马星形胶质细胞vimentin表达的影响Western blot条带光密度分析显示含IL-1β15 ng/ml的激活组的光密度值较对照组增加1.2倍,且有显著性差异（P＜0.01）,说明IL-1β激活的星形胶质细胞表达vimentin显著增加。SSa各组的光密度值较激活组显著降低（P＜0.01）,SSa 1,0.5 mg/L可使星形胶质细胞vimentin表达量分别下降17.6%和23.8%。SSa1 mg/L给药组光密度值与对照组比较,无显著性差异（P=0.375）。6.SSa对IL-1β激活的大鼠海马星形胶质细胞p-JNK表达的影响Western blot条带光密度分析显示含IL-1β15 ng/ml的激活组的p-JNK光密度值较对照组增加1.1倍,且有显著性差异（P＜0.01）。SSa 1,0.5 mg/L两组的光密度值较激活组显著降低（P＜0.01）,分别下降7.7%和8.6%。与对照组比较,SSa 1 mg/L给药组光密度值差异无统计学意义（P=0.184）。7.SSa对IL-1β激活的大鼠海马星形胶质细胞NF-κB表达的影响Western blot条带光密度分析显示含IL-1β15 ng/ml的激活组NF-kB光密度值较对照组增加1.5倍,且有显著性差异（P＜0.01）。SSa各组的光密度值较激活组显著降低,SSa 1,0.5 mg/L可使星形胶质细胞GFAP表达分别下降32.6%和34.3%。与对照组比较,SSa 1 mg/L给药组光密度值差异无统计学意义（P=0.463）。四、结论1.SSa能够抑制IL-1β激活引起的“反应性星形胶质细胞增生”:SSa可抑制IL-1β激活下体外培养大鼠海马星形胶质细胞的增殖;SSa可阻滞IL-1β激活下星形胶质细胞进入分裂周期,维持与对照组相当的细胞周期;SSa可抑制IL-1β激活下大鼠海马星形胶质细胞引起的GFAP、vimentin的过度表达。2.SSa可能通过抑制JNK的磷酸化,阻止NF-κB的核转移,从而阻断IL-1β-MAPK/JNK-NF-κB这一信号转导通路最终抑制IL-1β对星形胶质细胞的激活。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 材料与方法
• 1.材料
• 2.方法
• 3.统计方法
• 结果
• 1.星形胶质细胞的培养和鉴定
• 2.SSa对IL-1β激活的大鼠海马星形胶质细胞增殖的影响
• 3.SSa对IL-1β激活的大鼠海马星形胶质细胞分裂周期的影响
• 4.SSa对IL-1β激活的大鼠海马星形胶质细胞GFAP表达的影响
• 5.SSa对IL-1β激活的大鼠海马星形胶质细胞vimentin表达的影响
• 6.SSa对IL-1β激活的大鼠海马星形胶质细胞p-JNK表达的影响
• 7.SSa对IL-1β激活的大鼠海马星形胶质细胞NF-κB表达的影响
• 讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 附录
• 英文缩略语表
• 攻读硕士学位期间成果
• 致谢
• 研究生毕业论文统计学审稿证明