对酒精性肝损伤具有保护作用的乳酸菌的筛选

论文摘要

肝损伤是临床常见的病理症状,许多因素如酒精、药物、病毒等均能导致肝损伤的产生,若诊治不当,会导致严重后果。目前,临床尚缺乏理想的预防药物。乳酸菌具有多种保健功能,已广泛地应用到食品和医药中,因此筛选获得对肝损伤具有保护作用的乳酸菌为相关保健食品应用奠定基础。本文对不同来源样品中筛选获得的乳酸菌,通过体外抗氧化活性,抑菌能力及破坏内毒素能力研究,筛选获得具有良好特性乳酸菌,并以急性酒精性肝损伤小鼠进行验证。1.研究了不同乳酸菌SOD活性。对本实验分离保藏的58株乳酸菌的SOD活性进行了比较,有12株乳酸菌发酵液SOD活性较高,超过了24.45U/mL,分别为:RS5、C8M、AP3、GP1、ST1、BF、绿杆、白杆、Lr-4、R26、F、LV108,而ST1的SOD活性最高,达到30.01U/mL。从长寿老人粪便中分离的菌株（除R02）SOD活性普遍较高,均超过24U/mL;从腐乳中分离的菌株活性普遍较低,活性最高仅为14.90U/mL（W4M）。2.研究了12株乳酸菌清除DPPH自由基能力。由清除DPPH自由基能力曲线来看,各菌株的清除能力均不强。比较而言ST1清除能力相对最强,清除DPPH自由基能力曲线为y=12.53x+10.78,清除50%自由基时,所需消耗的发酵液浓度仅为3.13%,其次为GP1,发酵液浓度为3.34%,BF,发酵液浓度为3.37%,绿杆,发酵液浓度为3.39%,AP3清除能力最弱,发酵液浓度为4.26%。3.研究了12株乳酸菌总抗氧化能力。通过研究发现,菌株GP1总抗氧化能力最强,发酵18h时达到17.35U/mL,其次为ST1,发酵18h时达到16.39U/mL,绿杆,发酵24h时达到15.92U/mL,BF,发酵18h时达到15.05U/mL,而C8M总抗氧化能力最低仅为8.37 U/mL。发酵时间对各菌株抗氧化活性影响较大,大部分菌株在12h至18h,抗氧化活性呈上升趋势,在18h至24h之间,抗氧化活性比较强,趋于比较稳定的阶段,24h后呈下降趋势。细胞破碎后各菌株的抗氧化能力均有所提高,菌株ST1提高的程度最大,总抗氧化能力上升了3.07U/mL,而AP3仅提高了0.14U/mL。4.研究了12株乳酸菌的抑菌能力。通过比较抑菌能力,有6株乳酸菌抑菌能力较强,分别为:GP1、ST1、BF、绿杆、LV108、Lr-4。其中,GP1抑制大肠杆菌能力最强,抑菌直径达到23.5mm,其次为Lr-4,抑菌直径为22.75mm,最弱为C8M和白杆,抑菌直径为19.75mm;GP1和F抑制沙门氏菌能力最强,抑菌直径达到26.75mm,其次为BF、ST1、Lr-4,抑菌直径为26mm,最弱为C8M,抑菌直径为24mm。调节pH值至6后,AP3、C8M、F、RS5失去抑菌能力,但其余菌株仍具有一定的抑菌效果,GP1抑菌能力仍最强,抑制大肠杆菌直径为13.50mm,抑制沙门氏菌直径为14.00mm。5.研究了抗氧化能力及抑菌能力均较强的6株乳酸菌破坏内毒素能力。结果显示,各菌株代谢产物直接破坏内毒素能力弱。当内毒素浓度为0.5eu/mL时,阳性对照OD值为0.376,此时破坏能力最强的绿杆OD值为0.316;当内毒素浓度为1eu/mL时,阳性对照OD值为0.627,此时破坏能力最强的BF的OD值为0.488,内毒素的残留量仍很高;当内毒素浓度为2eu/mL时,阳性对照OD值为1.11,而此时破坏能力最强的绿杆OD值为0.767,破坏效果仍不明显。而与内毒素共培养时乳酸菌破坏内毒素能力均具有明显效果且随着培养时间的延长破坏能力不断增强。GP1在培养24h时OD下降到0.19,BF、绿杆、ST1OD值也分别下降到0.27、0.28、0.35,而阳性对照OD值高达0.82。并且发现内毒素与乳酸菌共培养时,对乳酸菌生长影响不大。6.对筛选获得的菌株绿杆、GP1和ST1进行了鉴定。通过API系列鉴定条和16S rDNA基因测序与BLAST在线比对,发现API系列鉴定与分子鉴定结果一致。得出绿杆、GP1、ST1分别为鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、屎肠球菌（Enterococcus faecium）。7.对筛选获得的菌株以急性酒精肝损伤小鼠进行验证。乳酸菌表现出保护肝脏损伤的特征,乳酸菌组与模型组血清中谷氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、白蛋白（ALB）、总蛋白（TP）和肝脏中丙二醛（MDA）、还原性谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）、乙醇脱氢酶（ADH）水平比较,差异显著（P<0.05）,有效的保护了肝脏。普通乳酸菌对照C8M的护肝特性总体上不如GP1、绿杆、ST1、BF（阳性对照）,而GP1的总体效果最好,尤其是在肝脏脂质过氧化的几项指标中效果接近于空白组（P>0.05）,优于药物组和BF组。由此,所筛选获得的S. thermophilus GP1、E. faecium ST1、L.rhamnosus绿杆、Bifidobacterium lactis BF为具有酒精性肝损伤保护作用的优良乳酸菌。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 绪论
• 1.1 肝脏及功能
• 1.2 肝损伤
• 1.2.1 肝损伤的分类
• 1.2.2 酒精性肝损伤
• 1.2.2.1 酒精性肝损伤定义及类型
• 1.2.2.2 酒精性肝损伤机制
• 1.2.2.3 酒精性肝损伤的危害
• 1.2.2.4 保护酒精性肝损伤的功能评价
• 1.2.3 肝损伤的主要影响因素
• 1.2.3.1 肝损伤与自由基
• 1.2.3.2 肝损伤与内毒素
• 1.2.3.3 肝损伤与肠道微生态系统
• 1.2.3.4 肝损伤与其它
• 1.2.4 肝损伤保护的研究进展
• 1.3 乳酸菌
• 1.3.1 乳酸菌的定义
• 1.3.2 乳酸菌的保健功能
• 1.3.3 乳酸菌保护肝损伤的机制
• 1.4 本论文研究目的及意义
• 1.5 本课题研究的内容
• 2 乳酸菌抗氧化性的研究
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 乳酸菌
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 乳酸菌的培养
• 2.2.2 SOD 活性的测定
• 2.2.3 清除二苯代苦味肼基自由基（DPPH·）能力测定
• 2.2.4 总抗氧化能力的测定
• 2.2.5 数据统计
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 不同来源乳酸菌SOD 活性比较
• 2.3.1.1 乳扇中分离的乳酸菌在发酵过程中的SOD 活性比较
• 2.3.1.2 臭干、豆腐乳中分离的乳酸菌发酵过程中的SOD 活性比较
• 2.3.1.3 新疆马奶酒中分离的乳酸菌在发酵过程中的 SOD 活性比较
• 2.3.1.4 新疆天然混合菌株gz-08 中分离乳酸菌发酵过程中的SOD 活性比较
• 2.3.1.5 新疆传统乳制品中分离的乳酸菌在发酵过程中的 SOD 活性比较
• 2.3.1.6 长寿老人粪便中分离的乳酸菌在发酵过程中的 SOD 活性比较
• 2.3.1.7 乳酸菌SOD 活性比较
• 2.3.2 乳酸菌清除 DPPH·能力比较
• 2.3.4 乳酸菌总抗氧化能力比较
• 2.3.5 细胞破碎后对菌株总抗氧化能力的影响
• 2.4 结论
• 3 乳酸菌对大肠杆菌、沙门氏菌的抑制作用研究
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 主要试剂
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 菌株
• 3.1.4 仪器设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 乳酸菌的培养
• 3.2.2 乳酸菌发酵液的处理
• 3.2.3 大肠杆菌、沙门氏菌的培养
• 3.2.4 对致病性大肠杆菌、沙门氏菌抑制作用
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 乳酸菌不同发酵时间对大肠杆菌的抑制作用
• 3.3.2 乳酸菌不同发酵时间对沙门氏菌的抑制作用
• 3.3.3 发酵液经调节pH 值后对大肠杆菌、沙门氏菌抑制作用
• 3.4 结论
• 4 乳酸菌体外破坏内毒素的研究
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 主要试剂
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 主要仪器设备
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 器材去热原处理
• 4.2.2 乳酸菌培养
• 4.2.3 破坏内毒素能力测定
• 4.2.4 乳酸菌活菌数量的测定
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 乳酸菌代谢产物直接破坏内毒素能力比较
• 4.3.2 乳酸菌破碎细胞壁后破坏内毒素能力比较
• 4.3.3 与内毒素共培养时不同生长阶段乳酸菌破坏内毒素能力比较
• 4.3.4 内毒素对不同乳酸菌生长的影响
• 4.4 结论
• 5 乳酸菌的鉴定
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 主要试剂
• 5.1.2 主要仪器设备
• 5.2 方法
• 5.2.1 API 系列鉴定条鉴定
• 5.2.2 乳酸菌16SrDNA 序列测定及分析
• 5.2.2.1 乳酸菌 DNA 的提取
• 5.2.2.2 乳酸菌16SrDNA 扩增
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 API 系列鉴定条鉴定
• 5.3.2 乳酸菌基因组DNA 电泳图谱
• 5.3.3 16SrDNA 扩增及测序
• 5.3.4 16SrDNA 序列在线 BLAST 结果
• 5.4 结论
• 6乳酸菌对小鼠急性酒精性肝损伤的保护作用研究
• 6.1 实验材料
• 6.1.1 实验动物
• 6.1.2 主要试剂
• 6.1.3 主要仪器
• 6.2 方法
• 6.2.1 动物分组及处理
• 6.2.2 样本处理
• 6.2.3 指标检测
• 6.2.3.1 肝脏乙醇脱氢酶活力（ADH）测定
• 6.2.3.2 丙二醛（MDA）生成量测定
• 6.2.3.3 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定
• 6.2.3.4 还原性谷胱甘肽（GSH）含量测定
• 6.2.3.5 血清 ALT、AST 活性测定
• 6.2.3.6 总蛋白（TP）的测定
• 6.2.3.7 白蛋白（ALB）测定
• 6.2.3.8 甘油三酯（TG）的测定
• 6.2.3.9 病理检查
• 6.2.4 数据处理
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 造模后小鼠状态特征
• 6.3.2 乳酸菌对酒精性肝损伤小鼠血清中指标的影响
• 6.3.3 乳酸菌对酒精性肝损伤小鼠肝脏中指标的影响
• 6.3.4 小鼠肝组织病理切片观察
• 6.4 结论
• 7 结论与展望
• 7.1 结论
• 7.2 展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢