抗hTERT单链抗体的制备

论文摘要

近几年来,有关单链抗体在肿瘤免疫治疗中的研究进展较快。由于单链抗体分子量小、免疫原性低、组织穿透力强、特异性好,与单克隆抗体相比,在肿瘤的诊断和治疗方面展示了更好的应用前景。已发现大约85%的人类恶性肿瘤具有端粒酶活性,所以抑制端粒酶为抗肿瘤药物的设计提供了新的目标。大量研究表明, 端粒酶抑制剂将成为一种有效的新型抗肿瘤药物。本实验通过抗端粒酶逆转录酶（hTERT）单克隆抗体制备hTERT的单链抗体,研究其在Lewis肺癌细胞中的抑制肿瘤生长作用。采用RT-PCR技术从能持续分泌抗端粒酶hTERT单抗的杂交瘤细胞中克隆出抗体的轻链、重链可变区基因VL、VH 。Overlap PCR将VL和VH用（Gly4Ser）4连接成hTERT的ScFv基因,连入原核表达载体pET19b,构建成pET19b-ScFv,转入大肠杆菌BL21（DE3）中表达。通过SDS-PAGE和Western-blot分析,能够很好地检测到单链抗体的生物学活性。再将ScFv基因连入真核表达载体pEGFP-C1,构建成pEGFP-C1-ScFv,转染肿瘤细胞,表明其具有一定的抑制肿瘤细胞生长的作用。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 端粒酶与肿瘤
• 1.1.1 端粒
• 1.1.2 端粒酶
• 1.1.3 端粒-端粒酶假说
• 1.1.4 端粒酶与肿瘤的治疗
• 1.2 单链抗体与肿瘤
• 1.2.1 单链抗体
• 1.2.2 单链抗体的构建
• 1.2.3 单链抗体在肿瘤诊断治疗中的应用
• 1.2.4 单链抗体与病毒类疾病的诊治
• 1.2.5 单链抗体的改进
• 1.3 实验的目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 菌株与细胞系
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 常用储备液及缓冲液
• 2.1.5 细菌培养基
• 2.1.6 细胞培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 单克隆抗体可变区基因的克隆
• 2.2.2 端粒酶ScFv 的构建
• 2.2.3 真核表达载体的构建
• 2.2.4 端粒酶ScFv 的抗肿瘤作用检测
• 2.3 数据处理
• 3 实验结果
• 3.1 单克隆抗体可变区基因的克隆
• 3.1.1 小鼠杂交瘤细胞中抽提总RNA
• 3.1.2 扩增轻链、重链可变区cDNA
• 3.1.3 转化子的筛选
• 3.2 端粒酶scFv 的构建
• 3.2.1 轻链、重链的连接
• 3.2.2 转化子的筛选
• 3.2.3 阳性克隆小量表达筛选
• 3.2.4 目的蛋白的纯化
• 3.2.5 western blot 检测
• 3.3 真核载体的构建
• 3.3.1 转化子的筛选
• 3.3.2 质粒的双酶切消化
• 3.4 端粒酶ScFv 生物学活性的检测
• 4 讨论
• 4.1 构建抗端粒酶逆转录酶hTERT 单链抗体的必要性
• 4.2 linker 的选取
• 4.3 蛋白纯化标签的选取以及蛋白复性条件的摸索
• 4.4 选择pEGFP-C1 真核表达载体构建pEGFP-C1-ScFv
• 4.5 ScFv 的生物活性分析
• 4.6 展望
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文