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赭曲霉发酵产大黄素及其生物合成途径和诱发机制的研究

2020-12-07阅读(245)

赭曲霉发酵产大黄素及其生物合成途径和诱发机制的研究

论文摘要

大黄素（Emodin）,1,3,8-三羟基-6-甲基蒽醌,具有抗病毒、抗炎、抗肿瘤、抑菌、扩张血管、免疫抑制等多种生理功能,已经成为一种十分有前途的新型药物单体。目前大黄素的主要生产方式是从药用植物大黄、虎杖中提取,产量低,质量难以控制。而本实验室保藏的一株赭曲霉（Aspergillus ochraceus LP0201）在自然状态下便可以产生大黄素,为通过工业发酵的方式来高效地生产大黄素提供了可能。利用制备型HPLC纯化了大黄素单体。制备HPLC的条件为:流动相,甲醇:水（60:40,v/v）;进样量,300mg;柱温,室温;流量,60mL/min;检测波长,254nm。通过ESI-MS、ESI-MS/MS、UV-VIS、FT-IR、1H-NMR、13C-NMR和DEPT确证了大黄素的结构。通过N+离子注入获得大黄素高产菌株Aspergillus ochraceus LP0301,并优化了发酵条件,使其最终产率达1.453mg/L,比出发菌株提高2.96倍。优化后的培养基为:镁离子1.5 g/L,硝酸铵10g/L,蛋白胨10g/L,玉米淀粉75g/L;发酵条件为:温度30℃,转数140 r/min,初始pH为7,装液量80 mL（250 mL）,接种量10%,菌龄20h。研究了大黄素提取和精制方法。提取方式为有机溶剂回流法,提取条件为:料液比,1:12;醇浓度,100%;提取时间,1.5h。精制采用D101大孔树脂,上样流速为1.5mL/min,温度为20℃,上样液中大黄素含量为1.0mg/mL。以中性90%乙醇在50℃下,2.0mL/min的速率洗脱。短链脂肪酸、氨基酸添加和代谢抑制实验表明,大黄素由聚酮途径合成。通过RAPD分析,获得两个差异性扩增片断,一个片断与AY272043.1和AY583208.1同源,证实大黄素通过聚酮途径合成,另一个片断与XM002374227.1和AY585205.1同源,表明大黄素合成与氧自由基有关。通过HPLC-ESI-MS/MS对13C标记大黄素动态跟踪及13C在大黄素分子中分布,提出了大黄素合成前体物和延伸的单元均是乙酰辅酶A（或其衍生的二碳单位）,延伸共进行7轮。通过研究大黄素在细胞外对氧自由基的消除作用和测定发酵过程中SOD、CAT酶活,推测大黄素的诱发机制和生理功能可能是抑制体内氧自由基的增加。

论文目录

  • 中文摘要
  • Abstract
  • 第一章 文献综述
  • 1.1 大黄素的自然分布
  • 1.2 大黄素的生物活性
  • 1.2.1 大黄素与生物大分子的相互作用
  • 1.2.2 大黄素抗自由基及电化学活性
  • 1.2.3 大黄素的抗病毒、抗菌、抗虫作用
  • 1.3 大黄素的生理活性
  • 1.3.1 生物利用度分析
  • 1.3.2 大黄素的生理功能
  • 1.4 大黄素的制备
  • 1.4.1 大黄素从药用植物中的提取制备
  • 1.4.2 大黄素生物转化制备
  • 1.5 大黄素的含量测定
  • 1.5.1 药用植物中大黄素含量的测定
  • 1.5.2 中成药中大黄素含量的测定
  • 1.6 赭曲霉及其次生代谢产物研究
  • 1.7 本课题研究背景、内容及主要技术路线
  • 1.7.1 研究背景
  • 1.7.2 研究内容及技术路线
  • 第二章 大黄素的纯化与结构确认
  • 2.1 引言
  • 2.2 实验材料
  • 2.2.1 实验菌株
  • 2.2.2 实验试剂与耗材
  • 2.2.3 实验仪器
  • 2.3 实验方法
  • 2.3.1 菌株培养与色素发酵
  • 2.3.2 色素的分离纯化
  • 2.3.3 色素单体的制备
  • 2.3.4 色素单体的结构分析
  • 2.4 结果与分析
  • 2.4.1 色素的薄层色谱分析
  • 2.4.2 色素的硅胶柱分离
  • 2.4.3 色素单体的制备色谱纯化
  • 2.4.4 色素单体纯度分析
  • 2.4.5 色素的结构分析
  • 2.5 小结
  • 第三章 离子注入诱变与大黄素发酵条件优化
  • 3.1 引言
  • 3.2 实验材料
  • 3.2.1 实验菌株
  • 3.2.2 实验试剂与耗材
  • 3.2.3 实验仪器
  • 3.3 实验方法
  • 3.3.1 菌株培养与色素发酵
  • 3.3.2 大黄素的测定
  • 3.3.3 离子注入诱变
  • 3.3.4 高产菌株摇瓶发酵特性的测定
  • 3.3.5 高产菌株5 升发酵罐发酵特性的测定
  • 3.3.6 菌体外大黄素含量的测定
  • 3.3.7 赭曲霉菌丝体与主要药用植物中大黄素含量的测定
  • 3.4 结果与分析
  • 3.4.1 大黄素测定方法的分析
  • 3.4.2 离子注入诱变分析
  • 3.4.3 培养基对大黄素产量的影响
  • 3.4.4 摇瓶培养条件对大黄素产量的影响
  • 3.4.5 摇瓶发酵特性的分析
  • 3.4.6 发酵罐（5 升）中高产菌株发酵特性分析
  • 3.4.7 菌体内外大黄素含量的比较
  • 3.4.8 菌丝体与药用植物中大黄素含量的比较
  • 3.5 小结
  • 第四章 大黄素的提取和精制
  • 4.1 引言
  • 4.2 实验材料
  • 4.2.1 实验菌株
  • 4.2.2 实验试剂与耗材
  • 4.2.3 实验仪器
  • 4.3 实验方法
  • 4.3.1 原料粉碎
  • 4.3.2 碱热法提取大黄素
  • 4.3.3 有机溶剂法提取大黄素
  • 4.3.4 微波和超声辅助提取大黄素
  • 4.3.5 大黄素的精制
  • 4.4 结果与分析
  • 4.4.1 原料的粉碎度对大黄素提取的影响
  • 4.4.2 热碱法提取大黄素的分析
  • 4.4.3 有机溶剂法提取大黄素的分析
  • 4.4.4 两种提取方法的比较
  • 4.4.5 微波和超声波辅助提取大黄素的分析
  • 4.4.6 大黄素的精制条件的分析
  • 4.5 小结
  • 第五章 大黄素生物合成途径的研究
  • 5.1 引言
  • 5.2 实验材料与方法
  • 5.2.1 实验菌株
  • 5.2.2 实验试剂与耗材
  • 5.2.3 实验仪器
  • 5.3 实验方法
  • 5.3.1 菌株培养与色素发酵
  • 5.3.2 大黄素生物合成途径类型的判定
  • 5.3.3 大黄素生物合成的RAPD实验
  • 5.3.4 大黄素合成途径的LC-ESI-MS/MS实验
  • 5.4 结果与分析
  • 5.4.1 前体物与代谢抑制剂添加对大黄素合成的影响
  • 5.4.2 大黄素合成的RAPD分析
  • 5.4.3 大黄素合成途径的LC-ESI-MS/MS分析
  • 5.4.4 大黄素生物合成途径的预测
  • 5.5 小结
  • 第六章 大黄素合成的诱发机制与生理作用分析
  • 6.1 引言
  • 6.2 实验材料
  • 6.2.1 实验菌株
  • 6.2.2 实验试剂与耗材
  • 6.2.3 实验仪器
  • 6.3 实验方法
  • 6.3.1 大黄素5 升罐发酵
  • 6.3.2 大黄素清除氧自由基和过氧化氢能力的测定
  • 6.3.3 发酵中SOD和CAT酶活的测定
  • 6.3.4 发酵中氧自由基总量的ESR测定
  • 6.4 结果与分析
  • 6.4.1 大黄素对自由基和过氧化氢的清除作用分析
  • 6.4.2 超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（CAT）酶活分析
  • 6.4.3 发酵中菌体内氧自由基含量的分析
  • 6.4.4 赭曲霉产大黄素机制的分析
  • 6.5 小结
  • 第七章 总结与展望
  • 7.1 总结
  • 7.2 创新点
  • 7.3 展望
  • 参考文献
  • 致谢
  • 发表文章和科研情况

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