重组鸡白细胞介素18生物学活性检测及其对鸡免疫影响的研究

论文摘要

白细胞介素18（IL-18）具有广泛的生物学活性,能够促进γ-干扰素（IFN-γ）的产生,刺激淋巴细胞转化,增强NK细胞的杀伤活性,在介导细胞免疫、抵抗微生物感染方面具有重要的作用。对人和哺乳动物IL-18的研究已有许多报道。本研究室在2001年开展鸡白细胞介素18（ChIL-18）的研究,先后构建ChIL-18的重组质粒和原核表达系统、真核质粒及其表达系统,在此基础上,对纯化后的原核表达的重组鸡白细胞介素18产物进行生物学活性检测,对其在生产中的应用做了初步研究,同时对影响ChIL-18原核表达产物生物学活性的因素也进行了探讨。实验一MTT法检测鸡脾和外周血NK细胞杀伤活性方法的建立选取不同日龄的SPF鸡和肉鸡,通过贴壁法从血液和脾脏分离出NK细胞作为效应细胞,选择MDCC-MSB1和MDCC-MSBCU147分别作为靶细胞,二者按比例混合,孵育,利用MTT法检测靶细胞的活力反映效应细胞对靶细胞的杀伤活性,并对效靶比、作用时间进行比较,结果显示MSB-1和CU147均可作为NK细胞良好的靶细胞,但CU147更稳定;效靶比为20:150:1,作用时间816h杀伤效果稳定;50%DMF- 20%SDS混合物作为裂解液能够对结晶彻底溶解,优于其它溶解试剂如二甲基亚砜等。该方法为检测重组鸡白细胞介素18蛋白对NK细胞杀伤作用这一生物学活性奠定基础。实验二鸡白细胞介素-18（ChIL-18）重组蛋白的生物学活性检测对含有ChIL-18基因的质粒在大肠杆菌内进行诱导表达,经亲合层析法对表达产物进行纯化,用微量细胞病变抑制法——CEF-VSV系统,检测其对SPF鸡脾淋巴细胞诱导产生γ-干扰素（IFN-γ）的活性和其对病毒的抑制效果;用3H-TdR掺入法和MTT法分别检测其对T淋巴细胞诱导转化和NK细胞杀伤活性的作用。结果表明经诱导表达出分子量为44KD的目的蛋白（与GST融合表达）,纯化后得到去除菌体蛋白的高纯度目的蛋白;生物学活性检测表明该蛋白能够诱导脾细胞产生IFN-γ,当浓度为250ng/ml时诱导IFN-γ的活性最高,可达1×106U/ml;但该蛋白不能直接抑制VSV在CEF上生长;能够刺激淋巴细胞显著增殖,浓度为250ng/ml时效果最佳;适当浓度的rChIL-18蛋白能促进NK细胞的杀伤活性,浓度为150ng/ml时,作用最强。以上结果表明,利用原核表达的重组鸡白细胞介素-18蛋白具有与天然鸡IL-18蛋白一样较广泛的生物学活性,为进一步研究它在生产中的应用奠定了基础。

论文目录

• 英文缩写注释
• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 文献综述
• 1.1 细胞因子
• 1.2 白细胞介素18 的研究进展
• 1.3 IL-18 的生物学功能
• 1.4 原核表达产物的纯化方法
• 1.5 IL-18 生物学活性检测方法进展
• 1.6 T 淋巴细胞增殖反应和 NK 细胞的杀伤活性
• 1.7 IL-18 的免疫增强作用及其应用前景
• 结语
• 2 实验研究
• 2.1 实验一 MTT 法检测鸡脾和外周血NK 细胞杀伤活性方法的优化
• 2.1.1 材料方法
• 2.1.2 结果与分析
• 2.1.3 讨论
• 2.2 实验二鸡白细胞介素-18（ChIL-18）重组蛋白的生物学活性检测
• 2.2.1 材料与方法
• 2.2.2 结果
• 2.2.3 讨论
• 2.3 实验三鸡白细胞介素18 成熟蛋白基因原核表达产物和真核表达质粒作为免疫增强剂的研究
• 2.3.1 材料与方法
• 2.3.2 结果
• 2.3.3 讨论
• 2.4 实验四鸡白细胞介素18（rChIL-18）对 MDV 感染 SPF 鸡细胞免疫影响的研究
• 2.4.1 材料与方法
• 2.4.2 结果
• 2.4.3 讨论
• 2.5 实验五影响rChIL-18 原核表达、表达产物纯化、变性复性因素的试验性研究
• 2.5.1 影响rChIL-18 原核表达的因素
• 2.5.1.1 材料
• 2.5.1.2 方法与结果
• 2.5.2 复性方法对rChIL-18 原核表达蛋白复性率和生物学活性的影响
• 2.5.2.1 材料与方法
• 2.5.2.2 结果
• 2.5.2.3 讨论
• 3 总体结论
• 4 创新之处
• 5 参考文献
• 6 致谢
• 附1 博士期间发表论文