植物抗逆基因：GbTPS与BnPrx的克隆和表达分析

论文摘要

植物在生长发育过程中会遇到各种逆境的胁迫，为了对抗这些胁迫，他们在进化过程中形成了相应的应激机制。有些机制是为了适应某种特定的胁迫，比如说钠氢泵在耐盐中所起的作用；而有些却能够对多种胁迫具有适应性，如本研究中的磷酸海藻糖合成酶与过氧化物酶。这类抗逆基因的克隆对于我们了解植物的抗逆机制意义重大。此外，通过遗传工程将这些基因导入到植物当中，一方面可以更详细的了解其功能；另一方面也可以将它们应用于实践当中，比如提高农作物抗逆性。本文分别从古老药用裸子植物银杏和非常重要的农作物——油菜当中克隆出了磷酸海藻糖合成酶基因和过氧化物酶基因并进行了各方面的分析与功能验证，这两种植物对于逆境都具有相当好的抗性。1)银杏磷酸海藻糖合成酶在许多生物体中，海藻糖作为一种保护性的代谢产物，在植物对抗外界不良环境（如低温、干旱、营养匮乏、高温脱水及高盐）的过程中起到了重要作用。本文主要介绍了从高度耐干旱及严寒的“活化石”银杏中分离鉴定了一种编码海藻糖-6-磷酸合成酶同源基因的一段cDNA（GbTPS，GenBank Accession Number AY884150）。GbTPS编码一段长868个氨基酸的多肽链，其等电点为5.83，分子量为97.9 kD。氨基酸序列分析显示，GbTPS与第二类海藻糖合成酶具有很高的相似性（和AtTPS7具有67％的相似性）。但仅分别仅与大肠杆菌中的OstA及酿酒酵母中的ScTPS1具有17％和23％的相似性。基因组序列分析表明它含有两个内含子。另外，该基因的启动子序列也通过基因组步移的方法克隆出来。DNA凝胶印迹分析显示，GbTPS是一个小的多基因家族成员。RT-PCR的结果表明GbTPS在银杏中的表达有组织特异性，在不同的发育时间表达情况也存在着差异表明该基因可能跟发育有关。同时，在一系列的环境胁迫（如严寒，高盐，干旱及甘露醇较多）情况下，GbTPS也是诱导表达的。通过酵母互补实验发现该基因不能使突变体tps1和tps2恢复正常表型，可能具有其他的功能。为了更好的了解它的功能，分别将它的启动子和开放阅读框（open reading frame，ORF）构建到植物表达载体上转化烟草，做功能研究。2)油菜过氧化物酶利用RACE的方法，从油菜当中克隆到一个新的过氧化物酶基因，BnPrx（GenBank登录号：DQ078754）。该基因的cDNA全长为1307个碱基，包含有一个1062个碱基的ORF。这个ORF编码了一个354个氨基酸的过氧化物酶前体，其中N-端的31个氨基酸为信号肽，C-末端的15个氨基酸为前导肽。这个推测出来的蛋白分子量大小为38.86 kDa，预测的等电点为5.85。BnPRX与HRPC具有相当高的同源性（89％），而且它具有HRPC中出现的所有的活性位点。这些活性位点包括有：两个Ca2+结合位点，6个糖基化位点。此外，软件分析预测出来的BnPrx蛋白的三级结构也跟HPRC的非常的相似。通过基因组步移的方法，我们得到了BnPrx的基因组序列，当中含有3个内含子和4个外显子。在启动子区域发现了32个TATA盒、18个CAAT盒还有其他很多的顺式元件比如说伤诱导元件（WUN），甲基茉莉酸诱导元件（MeiRE）。Southern杂交结果表明BnPrx属于一个小的基因家族。通过PCR的方法构建了一系列的启动子序列缺失载体，构建到pCAMBIA1304载体上，通过农杆菌工程菌株EHA105转化烟草，对它的启动子功能进行了分析。杂交分析显示BnPrx在根、茎和叶当中都是一个组成性表达，在茎与叶当中表达量非常高。BnPrx也能够被甲基茉莉酸、水杨酸、低温和过氧化氢有诱导表达。对于BnPrx的克隆分析有助于我们对植物过氧化物酶的生理功能和分子进化进行进一步的详细了解，为我们寻找辣根过氧化物酶的替代物提供了一种新的方法。启动子序列的分析也可能为我们找到一个高效的诱导启动予，用于遗传工程。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第一章 文献综述
• 第一节 植物抗逆性研究进展
• 1.1 逆境引起的膜伤害
• 1.1.1 影响膜透性及结构
• 1.1.2 发生膜脂过氧化作用
• 1.1.3 引起渗透不平衡
• 1.1.4 引发氧自由基爆发
• 1.1.5 导致光合系统变化
• 1.2 植物的抗逆机制和遗传工程
• 1.2.1 逆境信号的传导
• 1.2.2 活性氧的清除
• 1.2.3 渗透调节物质的合成
• 1.2.4 大分子蛋白的产生和积累
• 第二节 植物过氧化物酶
• 2.1 植物过氧化物酶的分子、结构特点
• 2.2 植物过氧化物酶的分类
• 2.3 植物过氧化物酶的功能和应用
• 2.3.1 参与环境胁迫反应,清除活性氧
• 2.3.2 污水处理
• 2.3.3 癌症治疗
• 2.3.4 应用于商业试剂盒
• 第三节 海藻糖代谢的研究进展概述
• 3.1 海藻糖的功能、应用
• 3.1.1 海藻糖作为能量储存
• 3.1.2 海藻糖作为胁迫保护剂
• 3.1.3 生物反应的稳定剂与激活剂
• 3.1.4 生物制剂与细胞、器官的保存
• 3.1.5 提高植物的抗逆性
• 3.2 海藻糖的代谢
• 3.2.1 海藻糖的生物合成
• 3.2.2 海藻糖的降解
• 第二章 甘蓝型油菜过氧化物酶基因的克隆及表达分析
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株和载体
• 2.1.3 酶与试剂盒
• 2.1.4 试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 实验材料的准备
• 2.2.2 植物RNA的抽提及RNA质量检测
• 2.2.3 SDS法提取基因组DNA
• 2.2.4 DNA片段的回收、连接、克隆和测序
• 2.2.5 用RT-PCR的方法获得过BnPrx保守片段
• 2.2.6 BnPrx 3’端目的基因的扩增
• 2.2.7 BnPrx的5’RACE
• 2.2.8 BnPrx全长的获取
• 2.2.9 BnPrx基因组全长的克隆
• 2.2.10 BnPrx基因启动子区的克隆
• 2.2.11 BnPrx拷贝数的分析
• 2.2.12 BnPrx在不同盐诱导下的表达分析（Northern blotting）
• 2.2.13 生物信息分析
• 2.2.14 植物表达载体pC1304-BnPrx的构建和植物转化
• 2.2.15 BnPrx基因启动子的分析和转基因验证
• 2.3 实验结果与讨论
• 2.3.1 BnPrx cDNA的全长克隆和性质分析
• 2.3.2 BnPrx推导的蛋白质序列的性质分析
• 2.3.3 BnPrx蛋白的三级结构预测
• 2.3.4 BnPrx的分子进化分析
• 2.3.5 BnPrx的基因组结构
• 2.3.6 BnPrx启动子区域克隆、分析功能鉴定
• 2.3.7 BnPrx的Southern杂交结果
• 2.3.8 BnPrx的组织特异性表达检测
• 2.3.9 BnPrx在不同逆境下的表达图谱
• 2.3.10 BnPrx烟草转化载体的构建
• 2.4 BnPrx小结
• 第三章 银杏磷酸海藻糖合成酶基因的克隆、表达和功能分析
• 3.1 材料与试剂
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 菌株和载体
• 3.1.3 酶与试剂盒
• 3.1.4 试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 实验材料的准备
• 3.2.2 RNA的抽提及质量检测
• 3.2.3 CTAB法提取银杏基因组DNA
• 3.2.4 DNA片段的回收、连接、克隆和测序
• 3.2.5 GbTPS基因核心保守片段的克隆
• 2.2.6 GbTPS基因3’端的扩增
• 3.2.7 GbTPS基因5’末端克降
• 3.2.8 GbTPS基因全长的获取
• 3.2.9 GbTPS基因组全长的克隆
• 3.2.10 GbTPS基因5’和3’flanking区的克隆
• 3.2.10.1 walking文库的构建
• 3.2.10.2 GbTPS5’flanking区域walking
• 3.2.10.3 GbTPS3’flanking区域walking
• 3.2.11 GbTPS酵母表达载体的构建和功能互补
• 3.2.12 GbTPS的的拷贝数分析
• 3.2.13 GbTPS的表达情况分析（半定量RT-PCR）
• 3.2.14 GbTPS的生物信息学分析
• 3.2.15 GbTPS转基因烟草载体的构建
• 3.2.16 GbTPS启动子的功能分析
• 3.3 实验结果与讨论
• 3.3.1 GbTPS的克降与性质分析
• 3.3.2 GbTPS的基因组以及3’下游和5’上游序列克隆、分析
• 3.3.3 分子进化分析
• 3.3.4 Southern blotting分析
• 3.3.5 GbTPS组织特异性与个发育时期的表达情况
• 3.3.6 GbTPS在不同胁迫下的表达情况
• 3.3.7 酵母互补实验
• 3.3.8 GbTPS烟草转化载体的构建
• 3.4 GbTPS小结
• 参考文献
• 博士期间参与的其他工作
• 攻读博士学位期间发表的SCI论文
• 致谢