高产γ-氨基丁酸酵母菌株的诱变选育及发酵条件优化

论文摘要

γ-氨基丁酸（GABA）是一种广泛分布于动植物体内的非蛋白氨基酸,具有许多重要的生理功能。在植物中,γ-氨基丁酸（GABA）参与了植物抵御逆境胁迫反应,对病虫害的保卫反应等过程。在动物中,GABA作为哺乳动物中枢神经系统一种主要的抑制性神经递质,参与脑循环生理活动,具有降低血压、治疗癫病、镇静安神、促进睡眠、增强记忆力、控制哮喘、调节激素分泌、促进生殖、肾肝功能活化等功能,被广泛的应用于食品、医药等工业。因此对其作用机理、制备研究已经成为一个热点。目前主要通过大肠杆菌发酵生产GABA,但大肠杆菌存在着安全卫生方面的极大隐患。因此通过诱变的方法获得高产GABA的安全性菌种具有重要的意义。本论文以酵母菌为材料,使用亚硝基胍对菌株进行诱变,选育高产γ-氨基丁酸突变菌株,并对变异株摇瓶发酵条件进行了研究。主要的实验结果如下:1.亚硝基浓度及处理时间对菌株的生长都有影响,确定了亚硝基诱变酵母菌的最佳浓度为1.0mg/ml,最佳处理时间为10min。亚硝基诱变后的菌株经过含甲基酚绿筛选培养基粗筛和薄层层析定性鉴定及分光光度法定量鉴定粗筛菌发酵液中γ-氨基丁酸含量后,从中选出高产γ-氨基丁酸突变菌株。对突变菌株后代遗传稳定性进行了鉴定,结果表明突变菌株4是遗传稳定的。2.对突变菌株4的发酵培养基及培养条件进行了优化。研究了碳源、氮源和无机盐对菌株发酵生产γ-氨基丁酸的影响,确定合适的碳源为葡萄糖;最佳氮源为蛋白胨和硫酸铵复合氮源;合适的无机盐为KH2PO4,其浓度对对菌株发酵生产γ-氨基丁酸无大的影响。正交设计实验结果确定发酵最佳培养基为3%葡萄糖,3%蛋白胨,0 3%（NH4）2SO4和0.1%KH2PO4。考察了培养温度℃、培养基起始pH值、接种量、种龄、培养时间及摇床转速对菌株发酵生产γ-氨基丁酸的影响,结果表明适宜的摇瓶发酵条件为:培养温度30℃,培养基起始pH值为5.5,摇床转速220r/min,接种量4%,种龄为2d的种子菌,培养时间4d。在此发酵条件下,变异菌发酵液中γ-氨基丁酸含量高达2.588g/l。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 γ-氨基丁酸的性质和代谢
• 2 γ-氨基丁酸的生理作用
• 2.1 γ-氨基丁酸在高等植物内的生理作用
• 2.1.1 参与抵御逆境胁迫反应
• 2.1.2 可作为氮的贮存形式
• 2.1.3 对病、虫害有保卫反应
• 2.1.4 诱导乙烯合成
• 2.1.5 与植物生长有关系
• 2.2 γ-氨基丁酸在动物内的生理作用
• 2.2.1 降血压
• 2.2.2 治疗癫痫病
• 2.2.3 促进睡眠,增强记忆力
• 2.2.4 γ-氨基丁酸对脑缺氧和缺血中的保护作用
• 2.2.5 γ-氨基氨基丁酸对呼吸系统的作用
• 2.2.6 γ-氨基丁酸对血糖和胰岛素的影响
• 2.2.7 γ-氨基丁酸对生殖生理的作用
• 2.2.8 其它功能
• 3 γ-氨基丁酸的应用
• 3.1 在医药上的应用
• 3.2 在食品中的使用
• 3.3 作为激素应用于植物保护
• 4 GABA的生产研究
• 4.1 化学合成法
• 4.2 从高等植物富集GABA
• 4.3 发酵法生产
• 5 影响GABA微生物发酵生产的因素
• 5.1 生产菌株
• 5.2 发酵条件
• 5.2.1 温度
• 5.2.2 pH值
• 5.2.3 辅酶
• 5.2.4 抑制剂
• 6 论文立题背景
• 7 本研究的主要内容
• 第二章 高产γ-氨基丁酸酵母菌的诱变选育
• 1 材料和方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 试验菌株
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 主要的药品和设备
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 菌种活化
• 1.2.2 酵母菌的培养
• 1.2.3 亚硝基胍诱变酵母菌
• 1.2.4 菌株致死率的计算
• 1.2.5 诱变菌株的筛选
• 1.2.6 诱变菌株产γ-氨基丁酸定性分析
• 1.2.7 诱变菌株产γ-氨基丁酸含量测定
• 1.2.8 诱变菌株遗传稳定性的鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 亚硝基胍最佳诱变时间的确定
• 2.2 亚硝基胍最佳诱变浓度的确定
• 2.3 菌种的诱变及筛选
• 2.4 诱变菌产γ-氨基丁酸特性的鉴定
• 2.4.1 γ-氨基丁酸的定性分析
• 2.4.2 γ-氨基丁酸的定量分析
• 2.5 诱变菌株的遗传稳定性
• 3 讨论
• 第三章 诱变菌发酵产γ-氨基丁酸条件的优化
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 主要的药品和设备
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 菌种活化
• 1.2.2 种子培养
• 1.2.3 发酵液中γ-氨基丁酸含量的测定
• 1.2.4 培养基优化
• 1.2.5 发酵条件优化
• 2 结果与分析
• 2.1 培养基的优化
• 2.1.1 碳源对菌体发酵的影响
• 2.1.2 有机氮源对菌株发酵的影响
• 2.1.3 无机氮源对菌株发酵的影响
• 2.1.4 无机盐对菌体发酵的影响
• 2.1.5 培养基组成的优化
• 2.2 发酵条件的优化
• 2.2.1 初始pH对发酵的影响
• 2.2.2 培养温度对发酵的影响
• 2.2.3 摇床转速对发酵的影响
• 2.2.4 种龄对发酵的影响
• 2.2.5 接种量对发酵的影响
• 2.2.6 培养时间对发酵的影响
• 2.2.7 优化发酵条件下菌株产γ-氨基丁酸特性鉴定
• 3 讨论
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介