几个油菜不育胞质的mtDNA的SSR分析

论文摘要

本实验利用SSR分子标记技术,对不同胞质来源的15份油菜细胞质雄性不育材料的mtDNA进行了多态性分析和聚类比较,研究结果如下:1 mtDNA的SSR分析结果:从29对SSR引物中筛选到4对有多态性、扩增稳定、重复性好的引物,利用这4对具有较好多态性的引物以及优化的SSR体系进行实验材料的SSR分析,扩增产物经高浓度琼脂糖凝胶电泳,均得到了清晰的DNA扩增图谱,且重复性较好。扩增共获得30条清晰的多态性带,每对引物扩增出110条带,平均9.5条带。2实验材料的聚类分析结果:利用mtDNA的SSR分析资料,进行聚类分析,15份实验材料在相关系数为0.872时聚为7组:Ⅰ组:053、白原幼17、MXW、0510、05白三系9-6×05白三系8-1、05白三系26×05白三系67-2,由来源于B.cam. CMS的6份不育系构成;Ⅱ组:056、0601、0512,包括转育于pol CMS的3份B.cam. CMS材料;Ⅲ组:057,来源于B.cam. CMS;Ⅳ组:0511,来源于B.cam. CMS;Ⅴ组:055,来源于B.cam. CMS;Ⅵ组:058、059,包括2份B.napus CMS材料;Ⅶ组:陕2A。聚类分析结果表明,胞质来源相同的材料聚在一起;白菜型油菜不育系的mtDNA存在比较大的差异,057、055、0511分别独立建类,可能是一种新型白菜型油菜不育系。白菜型油菜不育系材料中,起源于白菜型油菜CMS的不育系与起源于甘蓝型不育细胞质的白菜型油菜不育系间mtDNA遗传差异较大,存在着丰富的多态性。3线粒体DNA的提取与纯化方法研究3.1分离线粒体时,采用6次差速离心去除杂质,使线粒体的纯度大大提高。在裂解液中加入β-巯基乙醇等成分,可以抑制油菜叶片中糖类、酚类物质以及色素对mtDNA产量的影响。同时提高裂解温度,延长裂解时间,使线粒体充分裂解,释放DNA。经过如上方法的处理,线粒体的产率明显提高。3.2提取mtDNA过程中,用新鲜材料提取的mtDNA纯度高无降解,而冻样则有降解现象,所以mtDNA提取最好使用新鲜材料。实验表明用该方法提取mtDNA,不仅省去了常规方法中一些较贵的试剂,且效果更佳。经DNA电泳检测、SSR扩增证明此方法得到的mtDNA可完全达到SSR标记和其它分子生物学研究的要求。4优化的SSR反应条件:SSR稳定性研究中,经过对扩增条件的优化,得出最佳SSR的反应条件为:总反应体系为25μl:模板mtDNA 1μ（l20ng）,10×buffe（r含20mmol/L MgCl2）2.0μl,1mmol/L dNTPs 2.0μl（终浓度为0.1mmol/L）,10μmol/L Primer 1.0μl（终浓度为0.5μmol/L）,2.5U/μl Taq酶0.5μl,ddH2O 18.5μl。反应循环条件:94℃预变性5min;然后94℃,50s高温变性;50s低温复性;72℃延伸,1min;35个循环后进入72℃,10min延伸。

论文目录

• 摘要
• SUMMARY
• 缩略词（abbreviation）
• 第一章 文献综述
• 1 植物细胞质雄性不育概述
• 2 植物雄性不育的类型
• 2.1 植物雄性不育类型概述
• 2.2 核质互作雄性不育
• 2.2.1 按不育胞质来源分类
• 2.2.2 按恢保关系分类
• 2.2.3 按花粉败育的时期和程度分类
• 2.2.4 按遗传特点分类
• 2.3 细胞核雄性（GMS）不育
• 3 植物细胞质雄性不育分子机理
• 3.1 植物线粒体与细胞质雄性不育
• 3.1.1 植物线粒体DNA 与CMS
• 3.1.2 植物线粒体基因与CMS
• 3.2 植物叶绿体与细胞质雄性不育
• 3.3 核质互作与细胞质雄性不育
• 4 油菜细胞质雄性不育（cms）类型
• 5 SSR 标记技术在植物遗传多样性研究上的应用
• 5.1 微卫星DNA 标记的原理及特点
• 5.2 微卫星标记DNA 技术的实验方法
• 5.3 微卫星DNA 标记在遗传多样性研究中的应用
• 第二章 研究目的及技术路线
• 1 本研究的目的意义
• 2 研究技术路线
• 第三章 几个油菜不育胞质的mtDNA 的SSR 分析
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 所需试剂及缓冲液的配制
• 1.2.2 所用主要设备的规格及产地
• 1.2.3 油菜叶片mtDNA 的提取与纯化
• 1.2.4 mtDNA 的纯度及浓度测定
• 1.2.5 SSR 标记稳定性探索实验
• 1.2.6 PCR 反应体系
• 1.2.7 扩增条件探索
• 1.2.8 引物筛选
• 1.2.9 扩增产物检测
• 1.3 谱带的记录及数据分析
• 2 结果与分析
• 2.1 油菜mtDNA 紫外分光光度计检测结果及琼脂糖凝胶电泳分析
• 2.2 油菜SSR-PCR 扩增体系的优化
• 2.2.1 模板对稳定性影响
• 2+)量对扩增的影响'>2.2.2 10×PCR buffer(主要含Mg²⁺)量对扩增的影响
• 2.2.3 dNTPs 浓度对稳定性影响
• 2.2.4 Taq 聚合酶浓度对稳定性的影响
• 2.2.5 引物量对稳定性影响
• 2.2.6 PCR 反应体系
• 2.2.7 扩增条件探索结果
• 2.2.8 SSR 扩增条件优化的结果
• 2.3 SSR 分析实验结果
• 2.3.1 SSR 引物的获得
• 2.3.2 引物的筛选
• 2.3.3 PCR 扩增结果
• 2.3.4 扩增产物的电泳检测
• 2.4 聚类分析结果
• 3 讨论
• 3.1 差速离心法分离线粒体DNA 的效应分析
• 3.2 引物的筛选
• 3.2.1 SSR 引物的获得
• 3.2.2 引物的筛选
• 3.3 PCR 反应体系各组分的影响
• 3.4 SSR 结果的稳定性
• 3.5 存在的问题及展望
• 4 结论
• 4.1 聚类分析结果
• 4.2 SSR 技术在本试验中的可行性分析
• 4.3 mtDNA 提取与纯化
• 4.4 最佳SSR 条件
• 致谢
• 参考文献
• 个人简介
• 导师简介