原代培养神经元类缺血再灌后UCP4的表达与ROS的关系及前列地尔干预的研究

论文摘要

目的:以原代培养神经元为研究对象,建立类缺血再灌注损伤模型,探讨原代培养神经元类缺血再灌后UCP4的表达与细胞内活性氧水平的变化及前列地尔对其影响。方法:1、原代神经元的培养:取新生24h以内的Wistar大鼠,断头消毒,无菌条件下分离皮质并剥离脑膜,将脑组织剪碎后用胰酶消化,后经过滤,离心,调整细胞浓度,将细胞用10%胎牛血清的DMEM培养基种植于培养板或玻片上。然后置于370C、5%CO2的培养箱中培养,48h后加阿糖胞苷以抑制非神经元过度增殖,以后每三天半量换液,并采用神经元特异性烯醇化酶(NSE)鉴定。2、类缺血再灌注模型的建立:将培养10d的细胞全量换为DMEM无糖无血清培养基,放入充有90%氮气的培养箱中培养30min。然后再换为完全培养基。放入5%CO2的培养箱内。3、实验分组:将体外培养10d的大鼠皮质神经元细胞,随机分为正常对照组(正常组)、类缺血再灌注组(缺血组)、类缺血再灌注加前列地尔组(实验组)。正常组正常条件培养,缺血组按上述模型建立,然后转入正常条件下继续培养3 h、6h、12h分别取出细胞进行实验;实验组在类缺血再灌注模型基础上于缺血前加入0.01mg/mL的前列地尔。4、免疫细胞化学染色检测UCP4的表达:取出生长有神经细胞的盖玻片,经冷冻的无水酒精固定,用UCP4一抗按SP法进行免疫细胞化学染色。5、流式细胞仪检测细胞内活性氧。6、统计学处理:数据均以均数±标准差表示,进行单因素方差分析、SNK法检验及两因素相关分析,P<0.05为有统计学意义。结果:通过原代神经元培养的方法,培养出了可供实验的原代神经元。并在此基础上成功建立了类缺血再灌注模型。免疫细胞化学染色显示类缺血再灌3h时UCP4的表达即降低,随着时间延长,其表达持续降低,与正常组比较在各时间点上均有差别(P<0.05),尤以再灌后6h、12h时降低明显(P<0.01)。对细胞内活性氧,在再灌注3 h、6h、12h三个不同时间点ROS亦随时间在增加,与正常组比较在各时间点上均有差别(P<0.05)。UCP4的表达与ROS量行相关分析显示二者呈负相关关系(r=0.745,P<0.05)。实验组(前列地尔干预组)在再灌后不同时间点UCP4的表达较类缺血再灌组均升高,同时ROS的含量亦降低(P<0.05)。与正常组比较在再灌后不同时间点亦有统计学差异(P<0.05)。结论:UCP4在类缺血再灌注后不同时间点的表达呈动态变化,在再灌注3 h时UCP4的表达即降低;再灌注6h时UCP4的表达明显降低,再灌注12h时其表达仍在下降,提示了UCP4可能参与了脑缺血再灌注损伤的病理过程;UCP4的表达变化可能影响细胞内活性氧的水平;前列地尔可能通过上调UCP4的表达减少了细胞内活性氧的产生,从而发挥保护神经细胞的作用

论文目录

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