奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌亚单位疫苗的研究

论文摘要

奶牛乳房炎（cow mastitis）主要是由病原微生物感染而引起奶牛乳房组织及乳头发炎的一种疾病。引起奶牛乳房炎的病原按种类可分为细菌、病毒、支原体和真菌4大类,其中金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的主要病原;而且奶牛乳腺组织一旦被金黄色葡萄球菌感染,就很难治愈,这是由于金黄色葡萄球菌作为一种接触传染的G+非专性乳腺寄生菌极易产生耐药性和具有定殖在细胞内的能力,而使感染经常会转为慢性所致。因此,机体细胞免疫的状态也对金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎的发展和转归具有重要的影响。金黄色葡萄球菌的黏附素识别并特异性的结合到组织、细胞的特定分子上是感染的关键,因此阻断细菌的黏附和在粘膜表面的定殖,可能是预防感染最有效的策略。凝集因子A（ClfA）、纤黏连结合蛋白（FnBPs）是与金黄色葡萄球菌引起奶牛乳房炎相关的重要黏附因子。据此,本研究在以前研究的基础上,采用PCR方法对牛粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和金黄色葡萄球菌FnBPB的D区以及ClfA的A区进行特异性的扩增,并通过重叠延伸PCR扩增GM-CSF-FnBPB、FnBPB-ClfA、GM-CSF-FnBPB-ClfA串联基因,构建克隆质粒,利用原核表达载体pET-32a（+）对串联基因片段进行融合表达,表达产物经SDS-PAGE电泳分析,证明所表达的蛋白大小分别为39kDa、51kDa、64kDa,Western-blot分析表明,该蛋白具有免疫反应性。在此基础上以纯化的融合蛋白、单独表达的黏附素、表达的细胞因子蛋白为疫苗对小鼠进行免疫试验,通过单独免疫、混合免疫等策略,经三次免疫后对小鼠的血清,通过ELISA、试管凝集试验测定FnBPB、ClfA的抗体滴度。结果表明:经三次免疫后小鼠血清中均产生了抗体,其中融合蛋白免疫组和混合免疫组与对照组相比差异极显著（P<0.01）,单一黏附素免疫组与对照组相比差异显著（P<0.05）,融合蛋白免疫组和混合免疫组与单一黏附素免疫组相比差异显著（P<0.05）;通过吞噬调理试验、抗体抗金黄色葡萄球菌粘附能力试验评价融合蛋白、混合免疫蛋白和单独表达的黏附素蛋白体液免疫效果。吞噬调理试验结果表明:融合蛋白和混合蛋白免疫小鼠的全血杀菌能力与空白对照组相比差异极显著（P<0.01）,单一黏附素免疫组与对照组相比差异显著（P<0.05）,融合蛋白免疫组和混合蛋白免疫组与单一黏附素免疫组相比差异显著（P<0.05）;抗体抗金黄色葡萄球菌粘附能力试验结果表明:融合蛋白免疫组和混合蛋白免疫组的小鼠血清孵育的金黄色葡萄球菌对牛纤维蛋白原和纤维结合素的黏附能力与空白对照组比相差异极显著（P<0.01）,而单一黏附素免疫组与空白对照组相比差异显著（P<0.05）,融合蛋白免疫组和混合蛋白免疫组与单一黏附素免疫组相比差异显著（P<0.05）。通过Thl/Th2类细胞因子水平检测和T淋巴细胞增殖试验进行细胞免疫的检测。Thl/Th2类细胞因子水平检测结果表明,融合蛋白免疫组和混合免疫组小鼠血清中Th1类细胞因子IL-2和IFN-γ的含量与对照组相比差异极显著（P<0.01）,单一黏附素免疫组与对照组相比差异显著（P<0.05）,融合蛋白免疫组和混合免疫组与单一黏附素免疫组相比差异显著（P<0.05）;融合蛋白免疫组和混合免疫组小鼠血清中Th2类细胞因子IL-4和IL-10的含量与对照组相比差异极显著（P<0.01）,单一黏附素免疫组与对照组相比差异显著（P<0.05）,融合蛋白免疫组和混合免疫组与单一黏附素免疫组相比差异显著（P<0.05）。T淋巴细胞增殖试验结果表明:融合蛋白免疫组和混合免疫组T淋巴细胞增殖能力与对照组相比差异极显著（P<0.01）;单一黏附素蛋白免疫组与对照组相比差异显著（P<0.05）,融合蛋白免疫组和混合免疫组相比差异显著（P<0.05）。以上结果说明,我们研制的奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌亚单位疫苗可以诱导机体产生体液免疫和细胞免疫,为研制预防和治疗性金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎的基因工程亚单位疫苗提供了理论基础和实验依据。本研究的创新点:1.首次应用金黄色葡萄球菌黏附素ClfA和FnBPB基因与细胞因子GM-CSF构建基因工程亚单位疫苗,并证明了此融合蛋白可以诱导机体产生较好的细胞和体液免疫反应。高水平的抗体可以增强抗粘附作用;可以提高巨噬细胞、PMN的吞噬杀菌能力。2.插入分子量较小、柔韧性较好的Linker序列构建串联基因,并通过测序结果证明各基因片段串联顺序正确,没有出现阅读框的漂移,通过动物免疫试验证实Linker序列的插入不影响目的蛋白的表达和空间构象,保证了翻译蛋白的正确性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 奶牛乳腺炎的分类
• 1.1.1 传染性奶牛乳腺炎
• 1.1.2 环境性奶牛乳腺炎
• 1.1.3 凝固酶阴性葡萄球菌感染引起的奶牛乳腺炎
• 1.2 奶牛乳腺自我防御屏障的构成
• 1.2.1 奶牛乳腺的物理防御机制
• 1.2.2 乳腺的细胞防御机制
• 1.2.3 体液免疫机制
• 1.3 金黄色葡萄球菌导致奶牛乳房炎的致病机理
• 1.3.1 乳腺的感染
• 1.3.2 金黄色葡萄球菌在乳腺的粘附与定殖
• 1.4 金黄色葡萄球菌黏附素的研究进展
• 1.4.1 ClfA
• 1.4.2 FnbP
• 1.4.3 Cna
• 1.5 金黄色葡萄球菌疫苗研究进展
• 1.5.1 灭活苗
• 1.5.2 生物技术疫苗
• 1.6 免疫佐剂研究概况
• 1.6.1 γ-干扰素
• 1.6.2 粒细胞-巨噬细胞-集落刺激因子
• 1.7 展望
• 2 实验一 细胞因子IFN-γ和GM-CSF 的克隆、序列分析及表达
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验主要仪器
• 2.1.2 试剂与工具酶
• 2.1.3 载体及菌种
• 2.1.4 培养基与试剂
• 2.2 实验流程：如下流程图所示
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 引物设计
• 2.3.2 目的片段的扩增及重组载体的构建
• 2.3.3 阳性菌的保存及测序
• 2.3.4 bovIFN-γ、bovGM-CSF 蛋白的表达及分析
• 2.4 结果
• 2.4.1 牛外周血淋巴细胞总RNA 完整性的鉴定结果
• 2.4.2 RT-PCR 扩增结果
• 2.4.3 重组质粒pMD19-T-bovIFN-γ、pMD19-T-bovGM-CSF 的 PCR 鉴定结果
• 2.4.4 重组质粒pMD19-T-bovIFN-γ、pMD19-T-bovGM-CSF 的酶切鉴定结果
• 2.4.5 重组质粒pET32a-bovIFN-γ、pET32a-bovGM-CSF 的酶切鉴定结果
• 2.4.6 重组质粒pET32a-bovIFN-γ、pET32a-bovGM-CSF 的序列测定结果
• 2.4.7 表达产物的SDS-PAGE 电泳检测结果
• 2.4.8 目的蛋白纯化结果
• 2.4.9 表达产物的ELISA 检测结果
• 2.4.9.1 IFN-γ检测结果
• 2.4.9.2 GM-CSF 检测结果
• 2.5 讨论
• 2.5.1 牛外周血淋巴细胞的培养
• 2.5.2 IFN-γ基因片段和GM-CSF 基因片段的原核表达
• 2.6 小结
• 3 实验二 细胞因子GM-CSF 与FnBPB、ClfA 基因的串联、表达载体构建及表达
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 主要仪器
• 3.1.2 工具酶与试剂盒
• 3.1.3 质粒和菌株
• 3.1.4 试剂配制
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 实验流程
• 3.2.2 GM-CSF 与FnBPB 的D 区和ClfA 的A 区基因的串联方案及引物设计
• 3.2.3 目的片段与T 载体的连接
• 3.2.4 重组质粒的转化
• 3.2.5 重组质粒的提取
• 3.2.6 重组质粒的PCR 鉴定及双酶切鉴定
• 3.2.7 融合基因重组质粒的构建
• 3.2.8 重组质粒的转化
• 3.2.9 重组质粒的提取
• 3.2.10 重组载体的PCR 鉴定及双酶切鉴定
• 3.2.11 阳性菌的保存及测序
• 3.2.12 融合蛋白的表达及分析
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 融合基因PCR 扩增结果以及重组质粒的双酶切鉴定结果
• 3.3.2 重组质粒序列测定结果
• 3.3.3 目的蛋白可溶性确定
• 3.3.4 表达产物的SDS-PAGE 电泳
• 3.3.5 Western blot 分析结果
• 3.3.6 目的蛋白的纯化
• 3.3.7 重组蛋白浓度的测定
• 3.4 讨论
• 3.4.1 融合蛋白表达质粒的构建
• 3.4.2 表达系统的选择
• 3.4.3 融合蛋白的可溶性
• 3.4.4 重组蛋白的诱导分析
• 3.5 小结
• 4 实验三免疫试验研究
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 质粒和菌种
• 4.1.2 实验动物
• 4.1.3 主要试剂
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 实验流程
• 4.2.2 免疫动物
• 4.2.3 免疫程序与血样采集
• 4.2.4 免疫动物血清抗体检测
• 4.2.5 试管凝集实验
• 4.2.6 免疫血清的抗粘附力检测
• 4.2.7 吞噬调理实验
• 4.2.8 Thl/Th2 类细胞因子水平检测
• 4.2.9 T 细胞增殖实验
• 4.3 结果
• 4.3.1 血清抗体水平监测
• 4.3.2 试管凝集实验结果
• 4.3.3 抗体抗黏附检测结果
• 4.3.4 吞噬调理实验结果
• 4.3.5 Thl/Th2 类细胞因子水平检测结果
• 4.3.6 T 细胞增殖实验结果
• 4.4 讨论
• 4.4.1 基因工程亚单位疫苗的设计
• 4.4.2 细胞因子作为免疫佐剂的可能性
• 4.3.3 实验动物的选择
• 4.4.4 特异性抗体检测
• 4.4.5 调理吞噬作用
• 4.4.6 细胞因子检测
• 4.4.7 淋巴细胞增殖试验
• 4.5 小结
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介