华癸中生根瘤菌7653R共生固氮相关基因的克隆与功能鉴定

论文摘要

华癸中生根瘤菌（Mesorhizobium huakuii）能够与紫云英共生形成根瘤，具有严格的宿主专一性。本研究利用Tn5-sacB转座子对7653R菌株进行随机插入突变，从8000个突变子中筛选获得30个共生缺陷型突变株。使用TAIL-PCR方法克隆了突变株Tn5-sacB侧翼序列，结果发现有5个突变株的插入失活基因与百脉根中生根瘤菌（M．loti）的未知功能基因有很高的同源性，它们分别为opa22，lpsH，dmtH，gstH和catH。 opa22基因突变株不能形成根瘤，其编码产物包含257个氨基酸，分子量为28.1kDa。序列分析表明：Opa22蛋白与不透明蛋白和表面抗原有88.9％的相似性，该类蛋白主要存在于动物和植物病原细菌中，能参与细菌与寄主的相互识别，并刺激感染。根毛卷曲实验结果表明：Opa22蛋白可能在共生早期侵染线的形成与根瘤形成阶段发挥作用，其互补菌株HK24能恢复突变株的结瘤能力。 lpsH基因突变株形成无效根瘤，其编码产物包含397个氨基酸，分子量为43.6kDa。序列与结构分析结果表明：LpsH蛋白可能含有一个信号肽区、11个转膜区和一个定位于周质空间的O-抗原聚合酶结构域。其中O-抗原聚合酶为催化合成LPS的必要成分。SDS-PAGE研究结果表明：突变株LPS Ⅰ的含量明显低于野生型菌株。植物盆栽试验结果表明：lpsH基因突变株只有很弱的竞争结瘤能力。电镜观测结果表明：该突变株形成的根瘤含菌细胞含有少量正常的类菌体和大量正在衰亡的细胞碎片。因此，LpsH蛋白是参与LPS合成的膜蛋白，在共生固氮过程中有重要的作用。 dmtH基因突变株也形成无效根瘤，其编码产物包含249个氨基酸，分子量为27.3kDa。序列分析结果表明：DmtH蛋白与去甲基甲基萘醌甲基转移酶有89.6％的相似性，该酶在甲基萘醌合成的最后一步起去甲基作用。甲基萘醌是类菌体电子传递链的电子受体。因此，DmtH蛋白参与了类菌体的呼吸作用，在共生固氮过程中也有重要的作用。 gstH基因突变株不能形成根瘤，其编码产物包含327个氨基酸，分子量为37.3kDa。保守结构域分析结果表明：GstH蛋白具有谷胱苷肽硫基转移酶（Gst）家族的功能域，Gst能催化还原态的谷胱苷肽（GSH）通过巯基连接到多种特异性底物。有研究结果表明：GSH参与根瘤菌的抗氧化防御反应，在共生固氮过程中有重要的作用。gstH基因能互补突变株的共生能力。 catH基因突变株形成无效根瘤，其编码产物包含391个氨基酸，分子量为42.2kDa。保守结构域分析结果表明：CatH蛋白具有CoA转移酶家族Ⅲ的功能域。虽然有研究表明：CoA转移酶或CoA可能与根瘤菌的共生有关，但是catH基因是如何影响共生固氮作用仍未查明。植物盆栽试验结果表明：catH基因突变株只能形成

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语
• 1 前言
• 1.1 豆科植物根瘤形成的过程
• 1.2 结瘤基因及其调控
• 1.2.1 nodD
• 1.2.2 其它调节基因
• 1.2.3 结瘤因子
• 1.2.4 其它与结瘤有关的基因
• 1.3 固氮基因及其调控
• 1.3.1 固氮基因及其功能
• 1.3.1.1 nif基因
• 1.3.1.2 fix基因
• 1.3.2 固氮基因的调控
• 1.3.2.1 nifA的调控
• 1.3.2.2 FixL-FixJ调控系统
• 1.3.2.3 FixK调控
• 1.3.2.4 RpoN（s54）调控
• 1.3.2.5 NtrBC和NtrYX调控系统
• 1.4 多糖在共生固氮中的作用
• 1.4.1 EPS
• 1.4.2 KPS
• 1.4.3 LPS
• 1.5 根瘤菌的宿主专一性
• 1.5.1 根瘤菌与豆科植物互接种族关系
• 1.5.2 决定宿主专一性的因素
• 1.6 根瘤菌的分类
• 1.7 微生物基因组学研究
• 1.7.1 微生物基因组的测序与注释
• 1.7.2 微生物基因组生物信息学研究
• 1.7.3 微生物基因组学研究
• 1.7.4 基因芯片在微生物学研究中的应用
• 1.7.5 宏基因组技术在微生物中的作用
• 1.7.6 基因打靶技术在微生物中的应用
• 1.8 华癸中生根瘤菌研究进展
• 1.8.1 华癸中生根瘤菌的遗传多样性
• 1.8.2 华癸中生根瘤菌的质粒特征
• 1.8.3 华癸中生根瘤菌的共生基因与结瘤因子
• 1.8.4 华癸中生根瘤菌的胞外多糖
• 1.9 本研究的目的和意义
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 供试质粒和菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 抗生素
• 2.1.4 缓冲液与试剂
• 2.2 方法
• 3 结果与讨论
• 3.1 7653R菌株转座共生突变体的筛选及插入失活基因的克隆
• 3.1.1 7653R菌株Tn5-sacB共生突变体的筛选
• 3.1.1.1 7653R菌株Tn5-sacB插入缺陷突变体库的构建
• 3.1.1.2 Tn5-sacB插入突变体的共生功能鉴定
• 3.1.2 突变体Tn5-sacB插入失活基因的克隆
• 3.1.3 突变体Tn5-sacB插入失活基因的序列分析
• 3.1.4 讨论
• 3.2 opa22基因的克隆与功能鉴定
• 3.2.1 opa22全基因的克隆
• 3.2.2 opa22基因的序列分析及其蛋白同源性比较
• 3.2.3 Opa22蛋白的疏水性分析
• 3.2.4 opa22基因缺失突变体的验证
• 3.2.5 opa22基因缺失突变体的功能互补
• 3.2.6 opa22基因缺失突变体和互补菌株的共生表型
• 3.2.7 opa22基因缺失突变体的根毛侵染试验
• 3.2.8 讨论
• 3.3 lpsH基因的克隆与功能鉴定
• 3.3.1 lpsH全基因的克隆
• 3.3.2 lpsH基因的核苷酸序列分析及同源性比较
• 3.3.3 LpsH蛋白的转膜区和疏水性分析
• 3.3.4 lpsH基因重组突变体的构建
• 3.3.5 lpaH基因缺失突变体HK242的LPS结构
• 3.3.6 lpsH基因缺失突变体HK242的共生表型
• 3.3.7 lpsH基因缺失突变体HK242的竞争结瘤能力
• 3.3.8 lpsH基因缺失突变体HK242的结瘤效率试验
• 3.3.9 lpsH基因缺失突变体石蜡切片与电镜观察
• 3.3.10 讨论
• 3.4 dmtH基因的克隆与功能鉴定
• 3.4.1 dmtH全基因的克隆
• 3.4.2 dmtH基因的核苷酸序列分析及同源性比较
• 3.4.3 dmtH基因重组突变体的构建
• 3.4.4 dmtH基因缺失突变体的共生表型
• 3.4.5 讨论
• 3.5 gstH基因的克隆与功能研究
• 3.5.1 gstH全基因的克隆
• 3.5.2 gstH基因的核苷酸序列分析及同源性比较
• 3.5.3 gstH基因缺失突变体的验证
• 3.5.4 gstH基因缺失突变体的功能互补
• 3.5.5 gstH基因缺失突变体共生表型及功能互补
• 3.5.6 讨论
• 3.6 catH基因的克隆与功能鉴定
• 3.6.1 catH全基因的克隆
• 3.6.2 catH基因的核苷酸序列分析及同源性比较
• 3.6.3 catH基因重组突变体的构建
• 3.6.4 catH基因缺失突变体共生表型
• 3.6.5 catH基因缺失突变体HK33的竞争结瘤能力
• 3.6.6 讨论
• 4 总结和展望
• 4.1 总结
• 4.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历及论文发表情况