抗药木霉菌高效生防菌株生物学及其制剂加工技术

论文摘要

针对目前有关高抗多种化学杀菌剂的木霉(Trichoderma spp)菌研究较少的情况,本论文进行了两方面的研究。第一,以农药生产企业污水生化处理站的活性污泥为材料,利用平板稀释法分离到9株木霉菌株。通过生物测定表明,筛选菌株对生产中常用的化学杀菌剂具有很高的抗药性。明确了9个菌株的抗性生物学特性、抗药性稳定性和遗传特性。第二,研究了抗药性木霉菌株THY7的“开放式”新型发酵工艺、“伴侣式”新型制剂加工工艺以及“分离式”可湿性粉剂加工工艺,并对新制剂与化学杀菌剂联合作用控制番茄灰霉病进行了验证。具体研究结果如下:1高抗化学杀菌剂生防木霉菌株的筛选及抗药性生物学1.1抗药性木霉菌株的筛选以农药生产企业污水处理站活性污泥和污水为材料,利用平板稀释法分离纯化到9株木霉菌株,编号为:THY1~THY9;同时,从山东农业大学科技示范园土壤中分离纯化得到6株木霉,编号为:TAU1~TAU6。1.2木霉菌株对常用化学杀菌剂抗药性水平测定采用改进孢子萌发法和生长速率法,测定了12种生产中常用杀菌剂对木霉菌株的毒力。结果表明,9个木霉菌株对测定药剂多菌灵、甲基硫菌灵、乙霉威、三唑酮、福美双、代森锰锌、腐霉利、甲霜灵、霜脲氰、霜霉威等均具有高抗药性。从特殊环境中分离的高抗多种化学杀菌剂的木霉菌株在国内外尚未见报道。从土壤中分离的6个野生木霉菌株对苯基酰胺类的甲霜灵、氨基甲酸酯类的霜霉威和取代脲类的霜脲氰三类杀菌剂表现出较好的抗药性,EC50值都大于1000mg/L,对其它类别的杀菌剂则非常敏感。证明木霉菌存在自然抗药性现象,野生木霉菌的自然抗药性与菌株的来源无关,主要与杀菌剂的特性有关。这一研究结果对协调木霉菌生物防治和化学防治的关系有一定指导作用。1.3抗药性木霉菌株的生物学特性研究结果表明,来源于活性污泥的9个抗药性木霉菌株在孢子萌发、菌丝生长、产孢量、产几丁质酶活力、对病原菌的生防潜力、植物叶片和土壤中定殖能力等方面均表现出良好的特性,优于从土壤中筛选的野生菌株。9个菌株对多种病原菌生防作用显著,为植物病害生物防治和化学防治协同作用提供了理想的生防菌株。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 1 木霉菌生防作用研究
• 1.1 重寄生作用
• 1.2 抗菌素类物质抑菌作用
• 1.3 协同拮抗作用
• 1.4 竞争作用
• 1.5 诱导植物抗病性
• 2 生防木霉菌制剂加工技术研究
• 2.1 生防木霉菌发酵技术
• 2.2 助剂对木霉活力的影响
• 2.3 生防木霉菌制剂加工成功的例子
• 3 抗药性木霉菌的研究现状
• 3.1 抗药性木霉菌的筛选方法
• 3.1.1 紫外线诱变
• 3.1.2 含药培养基和紫外线、化学诱变剂诱导木霉菌株
• 3.1.3 原生质体融合技术
• 3.1.4 转化技术
• 3.2 生防木霉菌对苯并咪唑类杀菌剂的抗性分子机理
• 4 本研究的目的和意义
• 第一部分 生防木霉菌对杀菌剂的抗药性及抗药性遗传
• 1 材料与方法
• 1.1 活性污泥、污水及土样的采集
• 1.2 木霉分离用培养基
• 1.2.1 污水稀释液培养基（SEDA 培养基）
• 1.2.2 活性污泥浸出液培养基（ASDA 培养基）
• 1.2.3 土壤浸出液培养基（SODA 培养基）
• 1.2.4 PDA 培养基
• 1.2.5 查氏酵母浸膏培养基
• 1.3 木霉菌株的分离方法
• 1.3.1 平板稀释法
• 1.3.2 直接稀释法
• 1.4 木霉菌株的纯化鉴定与保存
• 1.4.1 木霉菌株的纯化、保存
• 1.4.2 木霉菌株的鉴定
• 1.5 木霉菌对常用化学杀菌剂的抗药性测定
• 1.5.1 化学杀菌剂原药
• 1.5.2 试验药剂的配制
• 1.5.3 木霉菌对杀菌剂的抗药性测定方法
• 1.6 抗药性木霉菌株主要生物学特性
• 1.6.1 温度对孢子萌发的影响
• 1.6.2 湿度对孢子萌发的影响
• 1.6.3 pH 值对孢子萌发的影响
• 1.6.4 温度对菌落生长的影响
• 1.6.5 pH 值对菌落生长的影响
• 1.6.6 抗药性和敏感木霉菌株产孢能力比较
• 1.6.7 抗药性木霉菌株产几丁质酶特性
• 1.6.8 抗药性木霉菌株的生防作用
• 1.6.9 抗药性木霉生防菌在番茄叶片和土壤中的定殖
• 1.7 抗药性木霉菌株的抗性稳定性和抗性遗传特性
• 1.7.1 抗药性稳定性研究方法
• 1.7.2 利用原生质体融合技术测定抗药性遗传性
• 2 结果与分析
• 2.1 木霉菌株分离培养基和分离方法的筛选
• 2.1.1 木霉菌株分离培养基的筛选
• 2.1.2 木霉分离方法的筛选
• 2.2 木霉菌株的筛选和纯化鉴定
• 2.3 12 种化学杀菌剂对木霉菌株的毒力测定结果
• 2.3.1 多菌灵对木霉菌株的毒力
• 2.3.2 甲基硫菌灵对木霉菌株的毒力
• 2.3.3 乙霉威对木霉菌株的毒力
• 2.3.4 腐霉利对木霉菌株的毒力
• 2.3.5 福美双对木霉菌株的毒力
• 2.3.6 三唑酮对木霉菌株的毒力
• 2.3.7 代森锰锌对木霉菌株的毒力
• 2.3.8 嘧霉胺对木霉菌株的毒力
• 2.3.9 甲霜灵等4 种杀菌剂对木霉菌株的毒力
• 2.4 抗药性木霉菌株的主要生物学特性研究
• 2.4.1 温度对孢子萌发的影响
• 2.4.2 湿度对孢子萌发的影响
• 2.4.3 pH 值对孢子萌发的影响
• 2.4.4 温度对菌落生长的影响
• 2.4.5 pH 值对菌落生长的影响
• 2.4.6 抗性和敏感木霉菌株产孢能力比较
• 2.5 抗药性木霉菌株产几丁质酶特性
• 2.5.1 抗药性木霉菌株产几丁质酶特性
• 2.6 抗药性木霉菌株的生防作用
• 2.7 抗药性木霉生防菌在番茄叶片和土壤中的定殖
• 2.7.1 抗药性木霉生防菌在番茄叶片的定殖
• 2.7.2 抗药性木霉生防菌在番茄根部定殖
• 2.8 抗药性木霉菌株的抗性稳定性和抗性遗传特性
• 2.8.1 抗药性木霉菌株的抗性稳定性
• 2.8.2 利用原生质体融合技术测定木霉菌抗药性遗传性
• 3 讨论
• 3.1 抗药性生防木霉菌的筛选
• 3.2 抗药性生防木霉菌株抗性稳定性
• 3.3 原生质体融合子对多菌灵抗药性遗传稳定性
• 4 结论
• 4.1 高抗化学杀菌剂生防木霉菌株的筛选
• 4.2 生防木霉菌株对化学杀菌剂的自然抗药性
• 4.3 抗药性生防木霉菌株的生物学特性
• 4.4 抗药性生防木霉菌株的抗性稳定性及抗性遗传
• 第二部分 抗药性生防木霉菌发酵新工艺及新型制剂加工
• 1 材料与方法
• 1.1 抗药性生防木霉菌株THY7 发酵新工艺
• 1.1.1 半开放式固体发酵法（无药培养基质固体发酵法）
• 1.1.2 开放式固体发酵法（含药培养基质固体发酵法）
• 1.2 抗药性生防木霉菌THY7 新型制剂加工技术
• 1.2.1 农药加工常用表面活性剂类助剂对孢子萌发和菌丝生长的影响
• 1.2.2 抗药性生防木霉菌“伴侣式”新型制剂加工技术
• 1.2.3 抗药性生防木霉菌THY7 高含量可湿性粉剂的加工技术－“分离式”加工技术
• 1.3 “伴侣式”木霉制剂与化学杀菌剂的联合作用
• 1.3.1 试验用材料
• 1.3.2 制剂处理浓度
• 1.3.3 试验设计
• 2 结果与分析
• 2.1 抗药性生防木霉菌THY7 发酵工艺
• 2.1.1 半开放式固体发酵法（无药培养基质固体发酵法）
• 2.1.2 开放式固体发酵法（含药培养基质固体发酵法）
• 2.2 抗药性生防木霉菌THY7 新制剂加工技术
• 2.2.1 农药加工常用表面活性剂类助剂对孢子萌发和菌丝生长的影响
• 2.2.2 抗药性生防木霉菌“伴侣式”新型制剂加工技术
• 2.2.3 抗药性生防木霉菌THY7 高含量可湿性粉剂的加工技术
• 2.3 “伴侣式”木霉制剂与化学杀菌剂的联合作用
• 3 讨论
• 3.1 生防木霉菌制剂加工技术
• 3.2 常用农药助剂对木霉生活力的影响
• 3.3 利用玉米秸秆发酵制备木霉孢子
• 4 结论
• 4.1 抗药性生防木霉菌THY7 发酵工艺
• 4.2 抗药性生防木霉菌THY7 新制剂加工技术
• 4.3 抗药性生防木霉制剂与化学杀菌剂的联合作用
• 参考文献
• 附录
• 1 试验图片
• 2 配制溶液
• 3 培养基
• 3.1 木霉菌株分离筛选和培养使用培养基
• 3.1.1 SEDA 培养基（污水稀释液培养基）
• 3.1.2 ASDA 培养基（活性污泥浸出液培养基）
• 3.1.3 SODA 培养基（土壤浸出液培养基）
• 3.1.4 PDA 培养基
• 3.1.5 查氏酵母浸膏培养基
• 3.2 原生质体融合使用培养基
• 3.2.1 TRS 培养基（亲本菌株培养基）
• 3.2.2 TRR 培养基（含多菌灵的融合子再生培养基）
• 3.2.3 TSS 培养基（不含多菌灵的融合子再生培养基）
• 4 试验主要试剂
• 5 主要仪器设备
• 致谢
• 攻读博士期间发表论文情况