PHA颗粒结合蛋白PhaP和RGD的融合蛋白与生物材料结合后对成纤维细胞L929和NIH/3T3生长的研究

论文摘要

PHAs,作为生物材料家族中的一员,因为其人工可控的优良的机械性能,自身的生物降解性和组织相容性,因此在组织工程中有广泛的应用。有文献报道称双亲性的PHA颗粒结合蛋白PhaP能够通过疏水作用与疏水材料,特别是PHA材料的表面结合。RGD多肽是一种能被许多细胞表面受体识别的细胞黏附因子。本文中,我们构建了质粒pPhaP-RGD,并用大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）表达融合蛋白PhaP-RGD,将三种高分子材料poly（3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxy-hexanoate）（PHBHHx）、poly（3-hydroxybutyrate-co-3-hy droxyvalerate）（PHBV）和polylactic acid （PLA）分别与PhaP-RGD孵育结合以后,与相同条件下未结合蛋白的同种材料相比,它们的亲水性都有明显地增加。而且实验证明,三种材料中PHBHHx与PhaP的结合力最强。体外实验表明,与PhaP-RGD孵育结合后的材料,与未经任何处理的材料和仅用PhaP孵育的材料相比,小鼠成纤维细胞L929和小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3都能更好的黏附和生长。甚至用无血清培养基培养这两种成纤维细胞时,在PhaP-RGD结合的PHBHHx,PHBV和PLA的材料上,两种细胞都能很好的生长和黏附,而在未处理的和仅用PhaP孵育的膜上,两种细胞生长状态很差。从这些研究中得出,PhaP-RGD能够作为一种疏水材料的黏附因子,进一步用于组织工程的体内研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 主要符号对照表及简称
• 第1章 前言
• 1.1 组织工程概述
• 1.2 聚羟基脂肪酸酯（PHA）的概述
• 1.3 PHA 在组织工程中的应用
• 1.4 PHA 的表面修饰方法
• 1.5 PHBV 和PHBHHx 的研究进展
• 1.6 PHA 颗粒结合蛋白（PhaP,Phasin）
• 1.7 精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）三肽序列在组织工程中的应用
• 1.8 本论文的目的和意义
• 第2章 实验材料与方法
• 2.1 实验材料和常用设备
• 2.1.1 菌种，质粒和细胞株
• 2.1.2 分子生物学常用的工具酶
• 2.1.3 常用试剂盒
• 2.1.4 基本实验材料
• 2.1.5 分子量标准物
• 2.1.6 聚合酶链式反应（PCR）用试剂
• 2.1.7 仪器和设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菌种保存方法
• 2.2.2 分子生物学操作中常用溶液的配制
• 2.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
• 2.2.4 细胞生物学中常用溶液的配制
• 2.2.5 细胞培养
• 2.2.6 材料成膜
• 2.2.7 膜接触角检测
• 2.2.8 重组质粒的构建
• 2.2.9 融合蛋白的表达，纯化和SDS-PAGE 检测
• 2.2.10 蛋白质含量的测定
• 2.2.11 含 PhaP 蛋白和疏水材料的相互作用检测
• 2.2.12 细胞接种
• 第3章 结果与讨论
• 3.1 质粒pPhaP-RGD 的构建结果
• 3.2 质粒pPhaP 的构建结果
• 3.3 PhaP-RGD 和PhaP 融合蛋白表达
• 3.3.1 pPhaP-RGD 和pPhaP 质粒转化E. coli BL21（DE3）
• 3.3.2 E.coli BL21 （DE3） pPhaP-RGD 和pPhaP 重组菌诱导表达和纯化
• 3.4 PI-eGFP 和疏水材料的相互作用检测
• 3.5 接触角研究
• 3.6 融合蛋白对成纤维细胞黏附的影响
• 3.7 细胞增殖实验
• 第4章 讨论
• 第5章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 发表论文情况
• 个人简历