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SARS病毒刺突蛋白片段的表达纯化及单克隆抗体的制备

2020-11-22阅读(530)

SARS病毒刺突蛋白片段的表达纯化及单克隆抗体的制备

论文摘要

始于中国南方并波及全球的重症急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome ,SARS）的暴发性流行严重影响人类的健康和生命。WHO已经确认SARS病原体为一种新的冠状病毒,命名为SARS冠状病毒（SARS-CoV）。研究发现SARS病毒刺突蛋白S2段的羧基端与鼠、牛冠状病毒刺突蛋白S2段具有明显的同源性。鼠、牛冠状病毒S2段有中和抗体表位,因此SARS病毒的S2段也可能存在能够激发中和抗体的表位。首先我们选取抗原表位相对集中的一段基因克隆至原核表达载体pET-28上,构建了含有SARS冠状病毒刺突蛋白片段的表达载体pET-28a/S2,并在大肠杆菌中获得了高表达（50%）,选择DEAE-Sepharose FF离子交换层析纯化,得到了纯度在90%以上的蛋白样品。然后,将纯化的SARS 抗原免疫小鼠,制备抗SARS 单克隆抗体。经ELISA 检测和筛选,获得一株稳定的抗SARS 刺突蛋白单克隆抗体株。该抗体能够识别SARS 抗原结合位点。以制备的抗SARS 单克隆抗体为第一抗体,HRP 标记山羊抗小鼠抗抗体为第二抗体,初步建立了SARS 刺突抗原检测方法。

论文目录

  • 第一章 前言
  • 1. 冠状病毒的概述
  • 1.1 冠状病毒分类
  • 1.2 人类的冠状病毒感染
  • 2. SARS-CoV的分子生物学
  • 2.1 SARS冠状病毒的形态学
  • 2.2 SARS冠状病毒基因组学研究
  • 2.3 SARS冠状病毒相关蛋白的研究
  • 2.4 SARS冠状病毒入侵宿主细胞
  • 2.5 SARS的临床表现、诊断与治疗
  • 第二章 材料
  • 第三章 方法
  • 1. SARS病毒刺突蛋白S2基因片段表达载体的构建
  • 2. SARS刺突蛋白片段在大肠杆菌中的表达
  • 2蛋白的诱导表达'>2.1 S2蛋白的诱导表达
  • 2.2 包涵体的洗涤、裂解
  • 2.3 层析纯化
  • 2.4 脱盐
  • 2.5 Western Blot检测
  • 3. 研究用乳糖替代IPTG在工程菌的发酵过程中作为诱导剂的影响因素
  • 3.1 乳糖诱导浓度的确定
  • 3.2 甘油和葡萄糖作为碳源时对乳糖、异乳糖诱导效果的影响
  • 2蛋白'>3.3 使用乳糖作为诱导剂在发酵罐中高效表达S2蛋白
  • 4. 抗SARS S2单克隆抗体的制备
  • 4.1 所需试剂的配制
  • 4.2 免疫程序及细胞融合
  • 4.3 阳性杂交瘤细胞株的筛选
  • 4.4 阳性杂交瘤细胞株的克隆化
  • 2单克隆抗体的检测'>4.5 抗SARS S2单克隆抗体的检测
  • 第四章 结果
  • 1. SARS病毒刺突蛋白S2基因片段表达载体的构建
  • 1.1 SARS刺突蛋白S2基因片段的扩增结果
  • 1.2 酶切法验证所构建的表达载体
  • 2基因测序结果'>1.3 SARS S2基因测序结果
  • 2. SARS刺突蛋白片段在大肠杆菌中的表达
  • 2蛋白的SDS-PAGE分析'>2.1 诱导表达的S2蛋白的SDS-PAGE分析
  • 2蛋白在细胞内以包涵体形式存在'>2.2 诱导表达的S2蛋白在细胞内以包涵体形式存在
  • 2.3 包涵体的洗涤、裂解
  • 2蛋白'>2.4 DEAE-Sepharose FF离子交换层析纯化S2蛋白
  • 2.5 脱盐
  • 2蛋白的免疫印迹分析'>2.6 大肠杆菌表达SARS S2蛋白的免疫印迹分析
  • 3. 研究用乳糖替代IPTG在工程菌的发酵过程中作为诱导剂的影响因素
  • 3.1 乳糖诱导浓度的确定
  • 3.2 不同碳源对乳糖和异乳糖的诱导作用的不同影响.
  • 3.3 使用乳糖在发酵罐中诱导表达目的蛋白
  • 2单克隆抗体的制备'>4. 抗SARS S2单克隆抗体的制备
  • 2单克隆抗体的筛选'>4.1 抗SARS S2单克隆抗体的筛选
  • 2单克隆抗体的检测'>4.2 抗SARS S2单克隆抗体的检测
  • 第五章 讨论
  • 1. SARS病毒刺突蛋白片段基因的选择
  • 2. 目的蛋白在大肠杆菌中的表达
  • 3. 诱导剂的选择与优化
  • 4. 表达产物的纯化
  • 5. SARS S2蛋白片段血清学鉴定
  • 6. 抗SARS刺突蛋白单克隆抗体
  • 结论
  • 参考文献
  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 致谢
  • 导师简介
  • 作者简介
  • 攻读硕士期间发表的学术论文及参与的科研课题

    • 相关论文文献

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