脂肪酶产生菌的筛选鉴定及相关研究

论文摘要

目的:以橄榄油为唯一碳源,筛选出具有转酯活性橄榄油的菌株,并对其进行鉴定。1、通过聚合酶链式反应手段扩增得菌株体内相应橄榄油基因;2、通过冷丙酮法提取粗酶进行制取生物柴油的实验。方法:橄榄油作为唯一的碳源来进行富集、用具有显色作用的指示剂来作为变色指示剂来进行选取适合的菌株,用摇瓶含有特定培养基的复筛的方法获得较高产脂肪酶的野生的菌株一株。并且利用两种方法,其一是平板扩散法其二是酸碱滴定法以及转酯的相关反应的综合型的技术实验方法,筛选出具有较高转酯活性的脂肪酶的野生菌株一株来;利用相关的实验室方法及冷丙酮法得到相应的野生菌株体内脂肪酶基因相对应的脂肪酶,实验室的相关条件包括叔丁醇作为相应溶剂,并且催化实验室甲醇与自行购买的棉籽油反应制取生物柴油;设计特定的引物来扩增菌株体内脂肪酶基因,有利于下一步继续试验。利用聚合酶链式反应扩增的手段来得到两个完整的脂肪酶的基因,制备感受态并且将目的基因转化进工程菌,经由菌落聚合酶链式反应来检测,最后将对筛选到的A2菌株即克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)在GenBank上Blast相应脂肪酶基因,然后设计引物两对,通过聚合酶链式反应扩增出全长分别为582bp和1623bp的两个脂肪酶基因,这两个基因都属于克雷伯氏菌的MGH 78578区段上的CDS。将测序结果序列在GenBank上注册,接受号分别是FJ615553和FJ615554。结果与结论:1.采集不同地方的土样,进行了脂肪酶产生菌大量的筛选工作。经以橄榄油为唯一的碳源、RhodamineB作为指示剂的平板初筛,并用摇瓶进行复筛及酸碱滴定法测定酶活,最终筛选出一株脂肪酶产生菌A2。菌株A2体内产生的脂肪酶可以催化转酯反应。通过对A2进行形态学观察,生理生化测定初步确定A2为克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)。2.对筛选到的A2菌株即克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)通过PCR扩增进行16S rDNA特征片段比较分析,证实A2菌株与克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)相似性达到99%,将测序结果序列在GenBank上注册,接受号是FJ615552。3.通过丙酮法获得A2菌株胞内脂肪酶,并用(NH)2SO4分级沉降法获得菌株胞外脂肪酶,进行酶活测定,胞外酶脂肪酶活性高于胞内脂肪酶活性。随后以叔丁醇作溶剂,催化棉籽油与甲醇反应制得了生物柴油。4.对筛选到的A2菌株即克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)在GenBank上Blast相应脂肪酶基因,然后设计引物两对,通过PCR扩增出全长分别为582bp和1623bp的两个脂肪酶基因,这两个基因都属于克雷伯氏菌的MGH 78578区段上的CDS。将测序结果序列在GenBank上注册,接受号分别是FJ615553和FJ615554。5.对A2菌株产酶条件的优化,转速在200r/min下培养48h产酶活力最高酶活力由最初的9.02U/mL提高到12.33U/mL。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 有关生物柴油
• 1.2 制备生物柴油
• 1.3 有关于脂肪酶
• 1.4 有关脂肪酶筛选
• 1.5 脂肪酶研究进展
• 1.6 本论文的研究意义和目的
• 2 试验材料
• 2.1 试验材料
• 3 试验方法
• 3.1 筛选菌株方法
• 3.2 实验室制取生物柴油
• 3.3 菌株生长曲线的绘制
• 3.4 提取菌株体内基因组
• 3.5 特定的设计引物
• 3.6 扩增和纯化目的脂肪酶基因
• 3.7 pGM-T 载体与脂肪酶基因的连接
• 3.8 感受态细胞的制备
• 3.9 菌落聚合酶链式反应
• 3.10 测序
• 4 试验结果与分析
• 4.1 菌种筛选结果
• 4.2 对细菌 A2 的鉴定
• 4.3 初步进行优化产酶的条件
• 4.4 生物柴油的制备
• 4.5 克隆脂肪酶基因
• 4.6 菌落聚合酶链式反应鉴定阳性转化子
• 4.7 测序分析
• 5 试验讨论
• 试验结论
• 参考文献
• 致谢（Acknowledgements）
• 导师评阅表