阿卡波糖产生菌的诱变育种及发酵条件优化

论文摘要

α-葡萄糖苷酶抑制剂能够抑制碳水化合物的水解,用途广泛。阿卡波糖（Acarbose）作为第一个用于临床治疗Ⅱ型糖尿病的α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物,自上市以来,由于其高效、安全而得到广泛应用。阿卡波糖可以竞争性地与小肠内的糖苷酶结合,延迟碳水化合物的水解,从而达到降低餐后血糖,治疗糖尿病的目的。目前,阿卡波糖主要通过游动放线菌（Actinoplanes sp.）等微生物发酵获得。本论文建立了一种糖苷酶抑制剂微孔板快速筛选方法,对实验室保藏的菌种进行了筛选,得到了一株阿卡波糖生产菌株A.utahensis ZJB08196,并利用低能离子束注入等诱变育种方法,对该菌株进行诱变改良,筛选到了高产突变株A.utahensis DG628-6-12,并对该突变株的发酵条件进行初步优化,显著提高了其发酵水平。首先,本论文根据2-氯-4-硝基苯-α-半乳糖-麦芽糖苷（Gal-G2-α-CNP）可以被α-淀粉酶水解产生生色基团2-氯-4-硝基苯酚（CNP）的反应原理建立了α-淀粉酶抑制剂筛选方法。考察了温度、pH等因素对显色反应的影响,并最终确定了一种基于96孔板的快速筛选方法:在最适pH 6.0,最适温度37℃条件下,反应体系为200 μl,其中α-淀粉酶液30μl,5 mmol/LGal-G2-α-CNP 40 μl,磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液100 μl（pH 6.0,50 mmol/L）,30 μl待筛选样品。本方法灵敏度高、方便、快捷。通过该方法加快了筛选速度,降低了筛选成本,提高了劳动效率。通过对实验室保藏菌株的初步筛选,得到了稳定性良好的出发菌株并确定了其平板、种子、发酵培养的基本条件。在此基础上,通过应用不同的诱变方法如UV-LiCl、γ-射线、N+低能离子注入进行单因子多轮复合诱变,并利用已建立的筛选方法进行突变株筛选,筛选得到的菌株阿卡波糖的产量分别提高了 30.18%,47.87%和51.33%。为了避免单因子诱变引起的“疲劳效应”,利用不同诱变因子进行复合诱变,最终获得了高产突变株A.utahensis DG628-6-12,其阿卡波糖产量达到4099 μg/ml,相对于出发菌株2018 μg/ml,提高了 103.12%。对突变株A.utahensis DG628-6-12的发酵培养基和发酵条件进行了优化,获得了较佳的阿卡波糖发酵工艺:葡萄糖和麦芽糖的含量分别为30g/L和60g/L,谷氨酸钠含量为4g/L,甘油4g/L,黄豆饼粉17 g/L,碳酸钙4.0 g/L。接种量为9%,起始pH为7.0,培养温度为28℃,最佳摇床转速为180 rpm,在500 ml三角瓶内最适装液量为50 ml。在较佳培养条件下,阿卡波糖的产量最高达到了 4470μg/ml。最后,考察了该菌株的发酵过程曲线。通过对突变株发酵过程中各种参数进行测定,掌握了发酵过程中,葡萄糖、麦芽糖、谷氨酸钠等基质的消耗情况以及菌体量、阿卡波糖、渗透压等参数的变化规律。初步确定,阿卡波糖属生长相关性代谢产物;在发酵后期,麦芽糖含量下降是阿卡波糖合成受阻的主要原因,补加麦芽糖有利于阿卡波糖的继续合成。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 糖尿病简介
• 1.2 糖尿病发展趋势
• 1.3 阿卡波糖的发现
• 1.4 常用的糖尿病治疗药物
• 1.5 阿卡波糖的结构以及理化性质
• 1.6 阿卡波糖的临床应用
• 1.7 阿卡波糖的生物合成途径研究进展
• 1.7.1 阿卡波糖的acb合成途径
• 1.7.2 阿卡波糖的gac合成途径与acb途径的比较
• 1.8 阿卡波糖菌种育种研究现状
• 1.9 阿卡波糖发酵条件研究现状
• 1.10 本研究的目的及拟采取研究路线
• 参考文献
• 第二章 菌株筛选方法的建立
• 引言
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 实验仪器与设备
• 2.1.4 培养基及试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 实验原理
• 2.2.2 实验步骤
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 阿卡波糖HPLC分析方法
• 2.3.2 CNP的检测
• 2.3.3 CNP标准曲线
• 2.3.4 最适反应条件的确定
• 2.3.5 抑制曲线
• 2.3.6 菌株筛选
• 2.4 本章小结
• 参考文献
• 第三章 诱变育种
• 引言
• 3.1 常用物理诱变方法
• 3.1.1 UV-LiCl
• 3.1.2 γ-射线
• 3.1.3 离子注入
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 菌种
• 3.2.2 试剂与药品
• 3.2.3 仪器设备
• 3.2.4 培养基
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 Actinoplanes utahensis ZJB-08196培养条件
• 3.3.2 UV-LiCl诱变
• 60C_oγ-谢线诱变'>3.3.3⁶⁰C_oγ-谢线诱变
• 3.3.4 低能离子注入诱变
• 3.3.5 多因素复合诱变
• 3.3.6 突变菌株保藏及传代稳定性考察
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 Actinoplanes utahensis ZJB-08196培养条件的确定
• 3.4.2 出发菌株筛选以及自然选育
• 3.4.3 UV-LiCl诱变
• 60Coγ-射线诱变'>3.4.4⁶⁰Coγ-射线诱变
• +注入诱变'>3.4.5 N⁺注入诱变
• 3.4.6 多因素复合诱变
• 3.4.7 突变株的遗传稳定性考察
• 3.5 本章小结
• 参考文献
• 第四章 突变株发酵条件优化
• 引言
• 4.1 实验材料与仪器
• 4.1.1 菌种
• 4.1.2 试剂与药品
• 4.1.3 主要仪器设备
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 菌种活化与转接
• 4.2.2 分析方法
• 4.2.3 种子培养条件优化
• 4.2.4 发酵培养基优化
• 4.2.5 培养条件优化
• 4.2.6 发酵曲线
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 种子培养基起始pH的影响
• 4.3.2 种子种龄对阿卡波糖产量的影响
• 4.3.3 发酵培养基优化
• 4.3.4 发酵条件优化
• 4.3.5 发酵过程曲线
• 4.4 本章小结
• 参考文献
• 第五章 总结与展望
• 5.1 总结
• 5.2 讨论与展望
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文
• 附录一
• 附录二