新疆细毛羊INHα亚基基因的克隆、序列分析与表达

论文摘要

抑制素（inhibin,INH）是一种主要由性腺产生的,由α和β亚基通过二硫键构成的异二聚体糖蛋白质激素,是转化生长因子β（transforming growth factorsβ,TGF-β）超家族成员。在体内,INH主要抑制促卵泡激素（follicle-stimulatinghormone,FSH）的合成和分泌。本研究研究了新疆细毛羊INHα亚基基因的克隆及其成熟区在表达菌株BL21（DE3）中的融合表达,以期为今后开展INH免疫对动物繁殖率影响的研究提供资料。根据GenBank上登录的新西兰绵羊抑制素α亚基基因序列（L28815）,设计合成了2对引物,以新疆细毛羊卵巢提取的总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增获得了约800bp片段,克隆到pMD18-T载体,经测序和序列分析证实为新疆细毛羊抑制素α亚基基因。测序结果表明扩增出一条长812bp的DNA片段,编码265个氨基酸残基的INHα亚基前体。新疆细毛羊与新西兰绵羊INHα亚基cDNA的同源性为98.6%,氨基酸的同源性为98.1%;成熟区核苷酸序列仅有1个碱基的差异,为同义变异。生物信息学分析表明:该序列与牛INHαcDNA的亲缘关系最近,为96.0%;其次与猪、马和人INHα的cDNA亲缘关系较近,分别有88.1%、87.8%和85.8%;而与小鼠和大鼠INHα的cDNA同源性较远,分别为84.2%和82.0%。新疆细毛羊INHα亚基成熟区包括134个氨基酸,分子量约为14.7ku,含1个糖基化位点、2个蛋白激酶C磷酸化位点、3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和7个半胱氨酸,氨基酸序列1-32区域存在抗原决定簇。以本研究构建的pMD-INH克隆载体为模板,采用PCR技术,扩增出新疆细毛羊INHα亚基成熟区的编码基因（411bp）,将纯化的PCR产物和表达质粒pET-32a（+）分别用限制性内切酶NcoⅠ和HindⅢ进行双酶切,回收目的片段,用T4 DNA连接酶将两者连接后转化到大肠杆菌DH5α中,筛选到INHα亚基重组原核表达质粒（pET-INH）,经测序证实插入的DNA序列阅读框正确,无突变。在低温条件下（30℃）,将携带有重组表达载体的大肠杆菌BL21（DE3）通过IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测,显示诱导表达蛋白大小约为32ku,与预期表达蛋白大小一致。Western blotting检测表明重组原核表达载体在大肠杆菌中成功表达出目的融合蛋白,并用渗透压休克法获得了融合表达产物,表明使用这种方法获取INH免疫原的途径是可行的。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 抑制素免疫在家畜繁殖中的应用
• 1.1 抑制素的来源
• 1.2 抑制素的结构与特性
• 1.3 抑制素的生物学作用
• 1.4 抑制素的作用机理
• 1.5 抑制素免疫在动物繁殖中的应用
• 1.6 问题与展望
• 2 研究对象
• 2.1 新疆细毛羊概况
• 2.2 主要产地和分布
• 2.3 体型外貌
• 2.4 生产性能
• 2.5 新疆细毛羊面临的问题
• 3 本研究的目的与意义
• 第二章 新疆细毛羊抑制素α亚基基因的克隆及序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 INHα亚基的克隆
• 2.2 测序结果及分析
• 2.3 与哺乳动物INHα亚基cDNA的同源性比较
• 2.4 与其它动物INHα亚基氨基酸序列的同源性比较
• 2.5 蛋白质二级结构的预测
• 2.6 亲水性、抗原表位的预测
• 3 讨论
• 3.1 重组质粒的构建
• 3.2 抑制素α亚基序列分析
• 3.3 抑制素α亚基二级结构的预测
• 4 本章小结
• 第三章 新疆细毛羊INHα亚基原核表达及鉴定
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 INHα亚基PCR产物的检测
• 2.2 重组表达质粒（pET-INH）的构建
• 2.3 重组表达质粒pET-INH在大肠杆菌中的诱导表达
• 2.4 目的蛋白的纯化
• 2.5 Western blotting检测
• 3.讨论
• 3.1 关于INHα亚基基因
• 3.2 关于pET表达系统
• 3.3 关于包涵体
• 3.4 重组质粒的表达、纯化和鉴定
• 3.5 影响INHα亚基蛋白表达量的因素及提高表达量的措施
• 4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录