促红细胞生成素对人视网膜色素上皮细胞保护作用的研究

论文摘要

目的:探讨人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）细胞损伤的分子机理、促红细胞生成素（Erythropoietin,EPO）对RPE细胞损伤的保护作用,为EPO在视网膜疾病中的临床应用提供理论依据。方法:一、体外原代培养人胚胎RPE细胞,传代至4～6代用于实验,免疫组织化学法对原代培养的RPE细胞进行鉴定,同时传代培养成人RPE细胞株ARPE-19,分别检测EPO和EPOR的在体外培养的正常人胚胎RPE细胞和成人RPE细胞的表达。二、建立RPE细胞氧化损伤模型和化学缺氧模型,四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测RPE细胞活力变化,免疫组织化学法和蛋白印迹（Western blot）法检测EPO和EPOR蛋白的表达变化。三、应用荧光素标记的连接素V-碘化丙锭（AnnexinV-PI）双染色流式细胞术和DNA片断电泳法检测氧化损伤RPE细胞凋亡变化,采用逆转录—聚合酶链反应（RT-PCR）法、Western blot法检测细胞凋亡相关因子clusterin的表达变化,免疫组织化学方法检测细胞凋亡相关因子Caspases—3,9的表达变化。四、添加外源性EPO作为EPO药物干预组,应用AnnexinV-PI双染色流式细胞术、RT-PCR和Western blot等多项分子生物学技术,比较应用EPO治疗前后的RPE细胞氧化损伤、凋亡和基因表达的改变,观察其对体外培养的RPE细胞的保护作用。结果:一、原代培养的人胚胎RPE细胞呈六边形,细胞浆内充满黑色素颗粒。随着传代次数增加,色素颗粒减少。传至4～6代,传代培养细胞为短梭形或纺锤形,颗粒少或无。免疫组织化学方法鉴定RPE细胞呈角蛋白阳性,GFAP阴性。成人RPE细胞（ARPE-19细胞株）以长梭形或三角形为主,单层贴壁生长,胞核透亮,胞浆丰富,细胞边界清楚。免疫组织化学方法鉴定,EPO和EPOR在正常人胚胎RPE细胞和成人RPE细胞均有表达,成人RPE细胞EPO表达相较于胚胎RPE细胞降低。二、氧化损伤组RPE细胞的细胞活力明显降低,化学缺氧组RPE细胞的细胞活力明显升高,化学缺氧组EPO和EPOR蛋白表达较正常组明显升高,氧化损伤组EPOR蛋白表达较正常组升高。三、氧化损伤导致RPE细胞死亡,AnnexinV-PI双染色流式细胞检测结果表明,在600umol/L过氧化氢损伤组,RPE细胞以凋亡为主要死亡方式。DNA片断电泳检测发现DNA阶梯状裂解的凋亡特异表现。RT-PCR和Western blot结果发现凋亡相关因子Clusterin随着过氧化氢作用时间的不同而表达变化,免疫组织化学法检测发现随着过氧化氢作用时间的延长Caspases—3,9的表达增强。四、相较于氧化损伤组,EPO药物干预组RPE细胞细胞活力升高,凋亡细胞百分数减少,凋亡相关因子Clusterin表达升高、Caspases—3,9的表达下降。结论:EPO和EPOR在正常人胚胎RPE细胞和成人RPE细胞均有

论文目录

• 引言
• 第一章 促红细胞生成素及其受体在人视网膜色素上皮细胞中的表达
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附图
• 第二章 RPE细胞氧化损伤模型的建立以及EPO和EPOR的表达变化
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附图
• 第三章 RPE细胞氧化损伤机制的探讨
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附图
• 第四章 EPO治疗干预对RPE细胞氧化损伤的保护作用的研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附图
• 综述
• 视网膜色素上皮与年龄相关性黄斑变性
• Clusterin与视网膜疾病
• 攻读学位期间的研究成果
• 致谢
• 独创性声明
• 学位论文知识产权权属声明