蛋白激酶Cξ在胶质瘤细胞和单核/巨噬细胞趋化运动中的功能研究

论文摘要

研究背景和目的:脑胶质瘤是神经系统发病率最高的肿瘤,其侵袭性的生长方式,是胶质瘤预后欠佳的重要原因。本研究第一部分探讨PKCξ在EGF诱导的两种人胶质瘤细胞运动和侵袭中的作用及其相关分子机制,以阐明PKCξ基因与胶质瘤细胞运动和侵袭、细胞外基质黏附、肌动蛋白聚合和解聚之间的关系。大量研究发现,在肺癌、乳腺癌等肿瘤组织中,巨噬细胞不仅不能清除肿瘤,反而主动抑制机体免疫应答,在肿瘤的发生、进展和转移等过程中起了促进作用。在本研究第二部分中,进一步利用小RNA干扰技术降低PKC在细胞中的表达水平,通过比较正常单核/巨噬细胞和转染干扰PKCξ表达质粒的单核/巨噬细胞,探讨PKC降表达对单核/巨噬细胞趋化运动能力的影响及其相关分子机制,明确PKCξ基因在单核/巨噬细胞趋化运动中的作用。研究方法:1)应用PKC家族抑制剂探讨非典型PKC亚家族在胶质瘤细胞和单核/巨噬细胞趋化运动中的作用。建立稳定转染空载体,稳定转染PKCξ降表达的胶质瘤细胞和单核/巨噬细胞。2)趋化运动实验和趋化动力学实验,探讨PKC降表达后对胶质瘤细胞和单核/巨噬细胞趋化运动能力的影响。3)肌动蛋白聚合实验,探讨趋化因子刺激不同时间后肌动蛋白聚合的变化,采用磷酸化特异性抗体检测不同PKCξ表达对趋化因子刺激后LIMK和cofilin磷酸化水平的影响。4)应用豆蔻酰化的PKCξ的特异性假底物进一步探讨PKC对胶质瘤细胞或单核/巨噬细胞趋化运动能力和肌动蛋白聚合的影响。5)应用StealthTM RNA降低PKC在小鼠腹腔巨噬细胞的表达,探讨PKC对CSF-1和MCP-1诱导的巨噬细胞趋化运动能力的影响。6)黏附实验检测PKC降表达对胶质瘤细胞黏附能力的影响,同时采用磷酸化特异性抗体检测不同PKCξ表达对EGF刺激后integrinβ1磷酸化水平的影响。7)体外侵袭实验检测PKC降表达对胶质瘤细胞侵袭能力的影响,同时将PKC降表达的胶质瘤细胞接种到裸鼠体内,观察PKC对体内胶质瘤细胞侵袭能力的影响。结果:1)应用PKC各亚型的抑制剂证实了非典型PKC在胶质瘤细胞和单核/巨噬细胞趋化运动中起到重要作用。2)应用小RNA干扰技术转染胶质瘤细胞和单核/巨噬细胞后,PKC的mRNA和蛋白水平均明显下降。3) PKC降表达的胶质瘤细胞和单核/巨噬细胞趋化运动能力比对照组细胞明显减弱（P<0.05）。4) PKC降表达的胶质瘤细胞和单核/巨噬细胞F-actin聚合比对照组细胞减少（P<0.05）。Western blotting证实,降低PKC的表达能够明显减低与F-actin聚合和解聚相关的LIMK和cofilin的磷酸化水平。5) PKC降表达的胶质瘤细胞比对照组的黏附数量明显减少（P<0.05）,而且与黏附功能相关的磷酸化integrinβ1的表达也明显降低。6)体内和体外实验均证实PKC降表达的胶质瘤细胞侵袭能力比对照组细胞明显减弱（P<0.05）,同时与细胞侵袭相关的MMP-9的表达也明显降低, MMP-2的表达没有检测到变化。7)应用化学合成的小RNA干扰技术转染小鼠腹腔巨噬细胞后,PKC降表达的巨噬细胞修复划痕的速度比对照细胞慢（P<0.05）。8) PKC降表达的巨噬细胞在CSF-1和MCP-1诱导的趋化运动能力比对照细胞明显减弱（P<0.05）结论:1) PKC参与了EGF诱导的胶质瘤细胞的运动和侵袭。PKC是通过调节LIMK/cofilin和integrinβ1的活化来调节胶质瘤细胞骨架重排和细胞黏附的。2) PKC参与了CSF-1诱导的单核/巨噬细胞的趋化运动。PKC是通过调节LIMK/cofilin的活化来调节单核/巨噬细胞细胞骨架重排的。3) PKC是G蛋白耦联受体和酪氨酸激酶受体两条信号传导通路的共同信号分子。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、PKCξ在胶质瘤细胞迁移和侵袭中的作用
• 1.1 对象和方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 二、PKCξ在单核/巨噬细胞趋化运动中的作用
• 2.1 对象和方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述
• PKCξ的功能及其研究进展
• 综述参考文献
• 致谢