拟南芥脂磷酸磷酸酶基因AtLPP1克隆及耐盐功能分析

论文摘要

采用电子克隆的方法从拟南芥中分离表达脂磷酸磷酸酶的其中一个基因AtLPP1（At2g01180）。AtLPP1编码328个氨基酸残基,它与拟南芥中其他三个LPPs基因有着高度的同源性,均可能包括六个跨膜区,有着高度保守的acidPPc结构域。定量RT-PCR分析的结果表明,AtLPP1在拟南芥叶片、茎、根、花等各个组织中均有表达;同时通过花浸泡法将构建的AtLPP1启动子区域驱动的GUS表达载体转入拟南芥中,获得AtLPP1启动子区域驱动的GUS转基因拟南芥植株。取生长期的拟南芥各组织进行GUS染色分析表明AtLPP1在多个组织中特异表达。构建了AtLPP1::YFP瞬时表达载体,采用PEG4000转化拟南芥原生质体,结果表明AtLPP1::YFP可能定位于原生质体细胞质膜和细胞内膜上。以往的研究表明拟南芥中AtLPP1基因受Gy,mastoparan,UV-B和harpin等的诱导,AtLPP2基本不受各种胁迫影响,相当于管家基因（Pierrugues et al.2001）。同时Katagiri等发现AtLPP2在种子萌发过程中参与PA调控途径。我们采用AtLPP1的缺失突变体lpp1进行LPP1的耐盐性生理分析,发现lpp1对盐胁迫敏感,将生长一个月的拟南芥植株用含有100mM NaCl的Hoagland营养液浇灌,一周后测定植株叶片的离子含量,发现AtLPP1的缺失突变体lpp1ma+离子含量明显升高,同时K+含量也较野生型明显降低,这说明AtLPP1的缺失影响了植株体内离子的平衡,这也是影响植物耐盐性水平下降的一个重要因素。Pi元素含量分析,我们发现lpp1植株较野生型水平略低,这可能是因为AtLPP1的缺失导致了植物体内PA含量下降。据此,我们在含NaCl的MS培养基中加入外源PA发现lpp1植株所受的盐胁迫明显降低,这说明AtLPP1缺失所导致的植株耐盐性下降与PA的合成有关,内源PA含量测定发现不管是在正常生长条件下还是盐胁迫下,lpp1植株体内PA含量比野生型明显降低。这进一步说明LPP1在植物体内的作用是生成PA。比较分析盐胁迫下lpp1和野生型萌发情况,我们发现100 mM NaCl下lpp1萌发率大幅下降,这进一步说明AtLPP1的缺失从种子萌发阶段开始影响植株的生长,降低了植株的耐盐性。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语
• 第一章 文献综述
• 第一节 高等动物中脂磷酸磷酸酶的研究进展
• 1.酶学特征
• 2.特异性表达
• 3.结构和膜拓扑结构
• 4.细胞内的定位
• 5.LPP是胞外酶吗?
• 6.LPPs是否调节胞内的脂代谢和信号途径
• 7.结束语
• 第二节 高等植物中脂磷酸磷酸酶的研究进展
• 1.表达LPPs的四个基因的结构特征
• 2.拟南芥中AtLPPs的表达水平
• 3.拟南芥中LPPs的生理功能
• 4.LPPs与PA、DGPP的关系研究
• 5.结语
• 第三节 植物耐盐性的研究进展
• 1.盐胁迫下植物的生理生化变化
• 1.1 膜透性的改变
• 1.2 对植物光合作用的影响
• 1.3 对植物物质代谢的影响
• 2.植物耐盐性机制
• 2.1 渗透调节
• 2.2 离子平衡
• 2.3 活性氧的清除
• 3.盐胁迫下植物基因的表达
• 3.1 脯氨酸合成相关基因
• 3.2 甜菜碱合成相关基因
• 3.3 胚胎发育晚期丰富（LEA）蛋白
• 3.4 活性氧清除酶类基因
• 3.5 水通道相关蛋白（aquaporin）
• 3.6 渗调蛋白（osmotins）
• +-ATPase（质子泵）基因'>3.7 H⁺-ATPase（质子泵）基因
• 3.8 与耐盐性相关的蛋白激酶（protein kinase）基因
• 第二章 拟南芥LPP1的表达模式及亚细胞定位分析
• 1、材料与方法
• 1.1 质粒与菌株
• 1.2 试剂
• 1.3.化合物
• 1.4.植物材料
• 1.5 常用的序列分析软件及网站
• 1.6 AtLPP1基因cDNA的克隆
• 1.7 AtLLP1的基因表达模式的分析
• 1.8 AtLPP1在拟南芥中的组织特异性表达
• 1.9 LPP1蛋白的亚细胞定位
• 2.结果分析
• 2.1 AtLPP1的基因序列与蛋白结构分析
• 2.2 AtLPP1基因的组织特异性表达
• 2.3 LPP1蛋白的亚细胞定位
• 3.讨论
• 第三章 拟南芥中LPP1在耐盐性中的作用分析
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 lpp1缺失突变体鉴定
• 1.3 Real-time PCR
• 1.4 发芽率测定
• 1.5 生物量测定
• 1.6 离子含量测定
• 1.7 脯氨酸提取和含量测定
• 1.8 蛋白提取
• 1.9 相对电导率测定
• 1.10 磷脂提取和含量分析
• 2 结果与分析
• 2.1 lpp1突变体中AtLPP1缺失
• 2.2 盐处理使拟南芥中AtLPP1基因表达水平上升
• 2.3 LPP1参与拟南芥萌发过程
• +,K⁺平衡'>2.4 LPP1参与拟南芥苗期生长阶段的Na⁺,K⁺平衡
• 2.5 盐胁迫下lpp1突变株中积累更多的脯氨酸。
• 2.6 盐胁迫下,相对电解质渗漏率的比较
• 2.7 盐胁迫下,植株内源PA含量分析
• 2.8 野生型与lpp1植株脂含量差异分析
• 2.9 外源PA缓解盐胁迫对lpp1突变体的伤害
• 3.讨论
• 第四章 全文结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录
• 致谢