乳鼠及犬脑组织中狂犬病病毒的分布定位研究

论文摘要

选取6日龄雄性昆明鼠,人工脑内接种狂犬病病毒SRV-9毒株,当其出现神经症状后,生物安全条件下,无菌采集脑组织,另外还有自然感染犬的脑组织,将每个脑组织一部分用4%多聚甲醛固定,另一部分应用套式RT-PCR及直接免疫荧光抗体试验进行检测。选择狂犬病病毒N基因保守区设计两对引物,外引物RHN1和RHN4,内引物RHN2和RHN3,建立狂犬病毒的套式RT-PCR检测方法,此方法可以特异地检测出狂犬病病毒SRV-9毒株的RNA,而对犬细小病毒（CPV）和犬瘟热病毒（CDV）均呈阴性。检测人工脑内接种狂犬病病毒SRV-9毒株的乳鼠及自然感染犬的脑组织样品,凝胶电泳观察均可以观察到特异的344bp的条带。此外,应用异硫氰酸荧光素标记的抗狂犬病病毒单克隆抗体进行直接免疫荧光抗体试验,在荧光显微镜下可观察到绿色荧光,即为狂犬病病毒抗原。建立间接免疫组织化学方法进行狂犬病病毒脑组织中的分布定位研究,优化免疫组织化学方法中的各种条件,通过辛酸-饱和硫酸铵沉淀法、DEAE52纤维素离子交换和蛋白A层析相结合的方法,制备纯化抗体,得到浓度为2.216mg/ml的马抗狂犬病病毒抗体及浓度为1.452mg/ml兔抗马IgG抗体,经碱性磷酸酶标记后,其浓度为0.97mg/ml、Dot-ELISA检测抗体效价为1:3200。通过反复试验确定以0.01M PH6.0柠檬酸缓冲液为抗原修复液,高温高压及胰蛋白酶消化法相结合的抗原修复方法,一抗及二抗的最佳工作浓度分别为1:50与1:100等为最佳条件,建立了敏感性高、稳定性强、可重复性高的免疫组织化学方法。应用建立的间接免疫组织化学方法,与组织病理学HE染色相比较,对上述10只人工感染狂犬病病毒的乳鼠及8只自然感染犬的脑组织中狂犬病病毒分布定位进行研究,得到了较好的效果,组织病理学HE染色乳鼠脑均未观察到病毒嗜酸性包涵体,在4只犬脑在小脑蒲肯野氏细胞胞浆中发现包涵体。而间接免疫组织化学方法染色均为阳性,其检出的阳性率与套式RT-PCR及直接免疫荧光抗体试验相符。脑组织中的病毒抗原在乳鼠及犬的大脑皮质的锥体细胞及小脑蒲肯野氏神经元等细胞胞浆中均呈强阳性;在乳鼠脑海马角CA1、CA3区神经元（包括齿状回）呈弱阳性分布,而在犬脑此区呈强阳性。本研究为狂犬病的发病机理、病毒抗原在感染动物机体内分布情况等基础性研究奠定了一定的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩写
• 前言
• 文献综述
• 第一章 狂犬病病毒及其检测方法的研究进展
• 1 狂犬病病原学
• 2 狂犬病病毒的分子生物学特性
• 3 狂犬病的传播途径
• 4 狂犬病病毒的致病机理
• 5 狂犬病病毒的流行病学
• 6 狂犬病病毒实验室检测技术的研究进展
• 7 免疫组织化学技术的研究进展
• 8 免疫组织化学技术在感染狂犬病病毒的动物组织内分布定位研究中的应用
• 试验部分
• 第二章 狂犬病病毒感染乳鼠及犬脑组织中的病原检测
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三章 乳鼠及犬脑内狂犬病病毒免疫组织化学方法分布定位研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 致谢
• 个人简介