一、筛选与克隆丙型肝炎病毒NS5A蛋白结合蛋白的基因（论文文献综述）
黄雯静[1]（2021）在《m6A甲基化修饰调控牛病毒性腹泻病毒NS5A的表达》文中进行了进一步梳理牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus,BVDV）属于黄病毒科、瘟病毒属,单股正链RNA病毒。NS5A是一种具有亲水活性的病毒非结构蛋白,黄病毒科各成员中的NS5A通过丝氨酸和苏氨酸残基的磷酸化,其在病毒生命周期具有一定的作用。据报道黄热病毒、丙型肝炎病毒等黄病毒科病毒基因组多个位点存在m6A甲基化修饰现象,NS3和NS5区域内富集了m6A位点,潜在保守的m6A位点可以调节病毒的成熟过程。研究表明m6A可机械调节丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus,HCV）颗粒的产生,敲低m6A甲基转移酶样蛋白3（methyltransferase like 3,METTL3）、甲基转移酶样蛋白14（methyltransferase like 14,METTL14）后显着增加了HCV NS5A蛋白的丰度;相反,敲低m6A去甲基化酶肥胖相关蛋白（fat mass and obesity-associated protein,FTO）后,NS5A蛋白表达明显降低。由于BVDV NS5A与HCV NS5A的结构和功能极为相似,推测m6A也可调控BVDV NS5A蛋白的表达水平,进而影响病毒颗粒的产生。本研究探讨了BVDV复制对m6A甲基化修饰的影响以及BVDV NS5A蛋白与m6A甲基化蛋白的关系,为深入了解m6A甲基化修饰调控病毒复制的分子机制奠定基础。首先,为了确定感染BVDV后MDBK细胞中的m6A甲基化水平变化,在病毒感染细胞后用q-PCR和Western-blot检测了甲基转移酶METTL3、METTL14和去甲基化酶FTO的转录和表达水平,以及甲基化结合蛋白YTH结构域蛋白YTHDF1（YTH domain-containing family protein 1）,YTHDF2（YTH domain-containing family protein2）,YTHDC1（YTH domain-containing protein1）的转录水平。结果显示,CP和NCP型BVDV感染后METTL3的转录和蛋白表达水平均下降,FTO的转录和蛋白表达水平均升高,YTHDF1转录水平下降,YTHDF2、YTHDC1转录水平均升高。研究表明CP和NCP型BVDV感染影响m6A甲基化蛋白的表达。其次,通过PCR扩增、胶回收、双酶切鉴定目的基因及表达载体、连接与转化等方法,构建了pcDA3.0-METTL3、pcDA3.0-METTL14、pcDA3.0-FTO真核表达质粒。将上述鉴定正确重组质粒通过磷酸钙法转染至293T细胞中,进行Western blot验证。结果显示,在64KDa、52KDa、58KDa处出现明显的目的条带,与预期大小一致。研究表明成功构建了牛METTL3、METTL14、FTO蛋白真核表达载体,并对牛METTL3和FTO蛋白进行生物信息学分析,对为后续研究奠定了基础。第三,利用生物信息学软件预测了牛METTL3蛋白与NS5A蛋白的互作,并利用Co-IP等方法验证其互作关系。预测结果表明牛METTL3蛋白与NS5A蛋白具备互作的可能性。将NS5A与METTL3质粒共转染至293T细胞中,通过Co-IP方法进行正反向互作分析。结果显示,METTL3蛋白与BVDV NS5A蛋白发生共沉淀;初步证明BVDV NS5A蛋白与甲基转移酶METTL3存在相互作用。在293T细胞中,过表达甲基转移酶METTL3蛋白能使BVDV NS5A蛋白表达量降低,过表达去甲基化酶FTO蛋白能使BVDV NS5A蛋白表达量升高,过表达BVDV NS5A蛋白能使甲基转移酶METTL3蛋白表达量降低,并使去甲基化酶FTO蛋白表达量升高。在MDBK细胞中,过表达甲基转移酶METTL3,能抑制病毒的复制。综上所述,本研究证明了CP和NCP型BVDV感染MDBK细胞后能够影响m6A甲基化蛋白表达水平;BVDV NS5A蛋白与甲基转移酶METTL3有相互作用,在293T细胞中过表达METTL3能使NS5A蛋白的表达量降低,过表达FTO能使NS5A蛋白的表达量升高。而过表达BVDV NS5A蛋白能是使METTL3的表达表达量降低,FTO的表达量升高。在MDBK细胞中,过表达甲基转移酶METTL3,能抑制病毒的复制。本研究为深入了解BVDV NS5A蛋白的功能及m6A甲基化修饰调控病毒复制的分子机制奠定了基础。
郭明哲[2]（2019）在《丙型肝炎病毒复制子新型构建方法的建立及基因3a、6a型病毒株耐药性的研究》文中研究指明HCV（Hepatitis C virus,HCV）丙型肝炎病毒是属于黄病毒科、丙型肝炎病毒属的单股正链RNA病毒。HCV在全球总人口的大约百分之一中以慢性感染的形式存在,因此HCV感染一直以来是一个沉重的社会负担。近年来直接抗病毒药物（Direct-acting antiviral agents,DAA）的出现使得HCV病人的治疗得到极大的改观。但临床资料显示DAA的耐药突变的产生仍是一个严峻的问题。绝大多数HCV病人样品中的HCV病毒无法在体外的肝癌细胞系中建立高效的感染,该现象的分子机制仍未被完全阐明。第一个高效的HCV体外感染模型在2005年由三个实验室同时创建并都依赖了JFH1（Japanese fulminant hepatitis1）共有序列。但迄今为止,JFH1共有序列是唯一一个不需要任何额外改变就能在肝癌细胞系中建立高效感染的HCV序列。由于共有序列无法反映出体内复制HCV序列的真实状态,因此我们拟通过筛选HCV病人血清中准种序列的方法来提高获得具有复制能力序列的可能性。为此我们建立了一种高效的构建HCV复制子cDNA文库的方法,并在稳定表达Sec14L2的Huh7.5.1细胞系中测试了多种基因型HCV复制子cDNA文库的集落形成能力。通过上述的功能筛选策略,我们成功地获得了基因1b,3a,6a型的HCV复制子克隆细胞,而且我们所获得的亚克隆HCV复制子cDNA都有较强的复制能力。后续的序列分析表明每个复制子细胞克隆中都含有不同数量的来自于准种序列的突变,因此我们的实验结果证明来自于准种序列的多样性可以帮助HCV病毒株在肝癌细胞系中复制。使用DAA疗法的基因3型病人的SVR（Sustained virological response）显着低于其他基因型。这个临床现象中比较重要的一个原因是基因3型HCV拥有天然的NS3 DAA耐药性。我们通过基因3a型复制子PR87A7研究了基因3型NS3168Q所介导的NS3 DAA耐药性。并且通过在基因2型的JFH1复制子中引入NS3 168Q及相关位点研究了NS3 168Q稳定存在的分子机制。我们发现NS3168Q的稳定存在需要NS3蛋白酶中其他残基的帮助,其中包括123T。研究显示索磷布韦耐药位点NS5B S282T可以在基因6型病人的基线序列中以较高的频率出现,因此基因6型HCV病毒株中产生索磷布韦耐药突变的壁垒可能低于其他基因型的HCV毒株。为了证明我们的假设,我们研究了基因6a型复制子PR58C4针对索磷布韦的耐药特性,结果显示PR58C4产生NS5B S282T的分子壁垒显着低于基因1b型的Con1复制子。NS5B S282T的产生导致了PR58C4对索磷布韦处理的敏感型的降低,并且NS5B K535R与NS5B S282T的同时存在可能提高了后者的耐药表型。综上所述,我们的研究建立了一种可以用于多种基因型HCV病人样本的复制子构建方法。基因1b型PR50,基因3a型PR87,基因6a型PR58复制子克隆的成功建立证明了我们上述功能筛选策略的通用性及有效性。在基因3a型PR87的耐药研究中,我们的结果对理解HCV耐药突变的产生与病毒复制能力维持之间的平衡提供了新的思路。在基因6a型PR58的索磷布韦耐药研究中,我们发现其产生NS5B S282T耐药突变的分子壁垒较低,同时发现了一个可以提高S282T耐药能力的突变K535R,这对理解临床中复杂耐药性的产生有重要意义。
覃煜雯[3]（2019）在《NLRX1和Sam68调控丙型肝炎病毒复制机制研究》文中研究指明丙型肝炎病毒（HCV）是一种重要的人类病原体,全世界有超过1.7亿人被感染,它可导致慢性肝炎、肝硬化、甚至肝癌。目前还没有有效针对丙型肝炎病毒的疫苗。HCV是一种单股正链RNA病毒,编码产生3种结构蛋白和7种非结构蛋白。HCV感染人类细胞后,受到宿主先天免疫应答的调控。病毒入侵宿主细胞后,模式识别受体RIG-I样受体识别病毒的病原相关分子模式（PAMPs）,RIG-I和MDA5被激活后发生构象变化,激活定位在线粒体外膜上的接头蛋白MAVS,MAVS招募并激活IRF3和NF-kB,最终诱导I型、III型干扰素以及其他抗病毒细胞因子的产生。我们的研究发现,HCV上调肝细胞内的NLRX1蛋白水平。沉默NLRX1可抑制HCV复制,而过表达NLRX1则促进HCV复制和病毒蛋白的积累。在稳定沉默NLRX1的细胞系中感染HCV,I型干扰素、III型干扰素和干扰素诱导基因（ISGs）的mRNA水平都明显上升。进一步研究发现,NLRX1与接头蛋白MAVS结合,诱导MAVS泛素化降解。深入研究发现,NLRX1与PCBP2相互作用,并促进MAVS的K48位泛素化。除了HCV之外,NLRX1对其它RNA病毒诱导的先天性免疫反应也起负调控作用。另外我们发现HCV感染诱使Sam68从细胞核转移到细胞质,Sam68结合于病毒基因组5’-UTR的第2个茎环结构,促进病毒复制。综上所述,NLRX1通过招募PCBP2促进关键信号分子MAVS的泛素化降解,从而抑制HCV诱导的人肝细胞先天免疫应答,最终导致导致HCV持续感染。Sam68直接靶向HCV基因组RNA,促进HCV在宿主细胞中复制。本研究工作寻找到了两个关键的宿主蛋白NLRX1和Sam68分别通过调控先天免疫信号通路和直接靶向HCV基因组RNA的方式,调控HCV在宿主细胞内的复制,本研究为在丙型肝炎病毒感染过程中宿主对病毒的调控机理的理解提供了新见解,也为开发潜在丙型肝炎病毒的疫苗提供了新思路。
向田[4]（2017）在《丙型肝炎病毒感染中异常表达的肝细胞糖复合物的相关研究》文中研究表明背景:丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus,HCV）感染可导致慢性肝炎,肝硬化甚至肝癌。根据2017年世界卫生组织报告,全球估计有近7100万慢性HCV感染患者,每年约有39.9万人死于与丙型肝炎相关的肝脏疾病。我国HCV感染者和发病者总数均居世界首位,且近年来一直呈上升趋势。目前国内临床标准治疗方法为聚乙二醇干扰素α（Peg-IFNα）联合利巴韦林（ribavirin,RBV）,但存在费用昂贵、副作用大等缺点。国外上市的DAAs（direct-actingantivirals）类药物,在HCV的治疗方面取得了重大进步。但是这些药物价格昂贵且因为HCV具有高度变异性,在治疗过程中可能会产生抗性突变毒株。蛋白质的糖基化修饰是一种极其重要的翻译后修饰,细胞中约80%蛋白都有糖基化修饰,主要由位于内质网和高尔基体中的糖基转移酶和糖苷酶有序调控完成。随着糖蛋白分析鉴定技术的发展,越来越多的研究表明糖蛋白异常糖基化修饰,尤其是N-糖基化修饰可作为生物标志物用于多种疾病（包括癌症）的诊断和预后评估。病毒感染后宿主细胞的N-糖表达谱的变化和糖识别模式的转变在一定程度上可以反映病毒感染的进展,有望作为病毒感染的诊断和治疗的新靶点。目的:近年来,寻找参与人类重要肝炎病毒感染与免疫致病的关键性宿主因子和翻译后修饰调控因子己成为研究热点。本研究拟从宿主方向着手对HCVcc感染人肝癌细胞Huh7.5.1过程中的异常糖基化及糖相关复合物进行探究。方法:本研究运用MALDI-TOF-MS（基质辅助激光解吸飞行时间质谱）技术比较分析了 Huh7.5.1肝癌细胞感染HCVcc（细胞来源的丙肝病毒）前后N-糖链的表达差异。同时,制备了 40种凝集素组成的芯片,用以对HCVcc感染时的糖苷变化进行分析。运用qRT-PCR检测了 12种岩藻糖转移酶在HCV感染Huh7.5.1细胞中的表达变化。另外,我们还运用mRNA表达谱芯片检测Huh7.5.1细胞感染HCV前后mRNA表达的差异。结果:运用MALDI-TOF-MS在正常Huh7.5.1细胞中鉴定到14种N-糖链,在HCVcc感染Huh7.5.1细胞中鉴定到21种N-糖链,两者均表达的有12种N-糖链。对N-糖链进行分类的相对含量分析发现在HCVcc感染的细胞中,岩藻糖型和唾液酸型以及复合型N-糖链结构明显上调。凝集素芯片发现在HCV感染的过程中,LCA、ACA、ECA这3种凝集素所识别的糖苷要明显高于未感染细胞（流式细胞术和共聚焦显微镜分析均已验证）。通过质谱鉴定HCV感染细胞中异常增高的凝集素LCA结合的靶蛋白,我们筛选出HSP90B1（内质网素,也叫热休克蛋白90B1）和ANXA2（膜联蛋白2）作为候选的差异表达的糖蛋白。Western blotting验证发现HCV感染并不能促进这两种蛋白的表达,但是能够上调它们的α1,6岩藻糖基化修饰。同时我们发现HCV感染Huh7.5.1细胞中糖基转移酶FUT8（α1,6岩藻糖转移酶）mRNA表达水平显着上调。进一步验证发现FUT8增强了HCV感染细胞中HSP90B1和ANXA2的岩藻糖基化修饰。且在HCV感染中,FUT8催化活性增强;上调的FUT8通过激活PI3K-AKT信号通路,促进HCV感染细胞的增殖;诱导了 HCV对抗病毒药物的耐药;降低了抗病毒药物对HCV的抑制作用,从而导致HCV复制的增加。对mRNA芯片结果进行qRT-PCR验证,将HCV感染后表达上调最高的基因之一 TNNT1作为研究靶基因。发现TNNT1上调细胞周期相关基因的表达,促进细胞增殖和HCV的复制,并筛选出在病毒感染时与TNNT1相互作用的蛋白MTA2结论:本研究筛选与鉴定了 HCV感染诱导的异常表达的相关糖复合物以及其他差异表达的分子,研究成果将为阐明HCV感染的分子机制提供理论基础,同时也为研发HCV感染新型诊断及防治标记物奠定基础,为寻找HCV药物靶点提供新的思路。
成军[5]（2004）在《科学研究的设计和方法中的科学性》文中指出生物学和医学的研究发展很快,不断有新的理论和技术出现,推动着生物学和医学领域的不断发展.现代分子生物学技术和理论为肝脏病学的研究提供了前所未有的机遇.由于发展不平衡,对于新理论和新技术的接受程度和推广还有一段艰难的过程.在这一过程中,不可避免地存在一些认识上的误差和偏差.因此本文选取3个有代表性的例子, 阐明科学研究的设计和方法中的科学性.
成军,杨倩,刘妍,王建军,纪冬[6]（2004）在《小鼠和大鼠NS5ATP4同源基因序列的生物信息学分析》文中认为目的:克隆、鉴定、分析小鼠和大鼠NS5ATP4基因序列, 确定编码产物序列,并对于其与人的NSSATP4基因及其编码产物的序列的同源性进行分析. 方法:利用基因芯片技术获得了人NS5ATP4的cDNA序列,利用生物信息学技术确定小鼠、大鼠的NS5ATP4的基因及其编码产物的序列,并对于其同源性进行生物信息学分析. 结果:利用生物信息学技术确定了小鼠和大鼠的NS5ATP4 的基因及其编码产物的序列,小鼠和大鼠的NS5ATP4编码基因区分别由762和756个核苷酸（nt）组成.编码产物分别由263和261个氨基酸残基（aa）组成.与人NS5ATP4基因和蛋白质一级结构序列的同源性分别为90.29%,84.25%和95.65%,86.96%. 结论:应用生物信息学技术确定了小鼠和大鼠的NS5ATP4 的基因及编码产物的序列.
成军,董菁,张健,王建军,纪冬,刘妍,钟彦伟,王琳[7]（2004）在《HBV前-S1蛋白结合蛋白大鼠同源基因的克隆化》文中提出目的:利用生物信息学（bioinformatics）技术克隆,鉴定人HBsAg前-S1蛋白结合蛋白（PS1BP）编码基因的同源基因. 方法:人PS1BP由表达型cDNA文库的噬菌体展示技术筛选获得.以人的PS1BP的cDNA序列作为参照,对于美国国立卫生研究院（MH）国立医学图书馆（NLM）生物工程信息学研究中心（NCBI）建立的核苷酸序列数据库GenBank,利用同源基因序列比对的在线分析软件BLASTn进行同源基因序列的比对,发现新的来源于大鼠的同源基因.确定大鼠PS1BP的cDNA序列之后,对于大鼠PSIBP蛋白质一级结构序列与人和小鼠的PS1BP蛋白质一级结构序列的同源性进行分析.利用在线分析软件,对于大鼠PS1BP一级结构序列中潜在的修饰和功能位点进行初步的预测分析. 结果:利用噬菌体展示技术获得了人的PS1BP的cDNA序列.以生物信息学技术确定了大鼠PS1BP的cDNA及其编码产物的序列.大鼠PS1BP的cDNA由1455 nt组成,编码产物由484 aa组成.大鼠PS1BP蛋白质一级结构与人和小鼠PS1BP蛋白质一级结构的同源性分别为80.79%（391/484）和92.98%（450/484）.利用在线分析软件,在大鼠PS1BP蛋白质一级结构中还发现了一系列潜在的蛋白质修饰结构位点. 结论:大鼠PS1BP基因及其编码产物序列被确定
成军,李克,刘妍,王琳,陆荫英,钟彦伟[8]（2004）在《HCBP6对HCV核心蛋白反式激活作用的影响》文中研究说明目的:研究HCBP6蛋白在细胞内表达时,是否通过蛋白- 蛋白之间的相互作用,对HCV核心蛋白的反式激活作用产生影响. 方法:利用常规的分子生物学技术分别构建HCBP6蛋白和丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白的真核表达载体.酶联免疫黏附法enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测CAT的表达水平,间接测定HCV核心蛋白对于SV40病毒即刻早期启动子的反式激活活性. 结果:重组表达载体pcDNA3.1（-）-HCBP6、pcDNA3.1（-）- core经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误.转染HepG2细胞之后,HCV核心蛋白的表达,对于SV40病毒即刻早期启动子的转录表达活性具有显着的反式激活作用.但是,当与HCBP6蛋白的表达载体进行共转染时,SV40病毒的即刻早期启动子的转录活性受到抑制.重复试验得到了相似的结果.HCBP6蛋白的表达对于HCV反式激活SV40病毒即刻早期启动转录活性的抑制率40.4-62.3%. 结论:HCBP6蛋白在细胞内的表达对HCV核心蛋白反式激活SV40病毒的即刻早期启动子的转录活性具有显着的抑制作用.
杨艳杰,成军,王春花,党晓燕,钟彦伟[9]（2004）在《丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因8的克隆化研究》文中认为目的 丙型肝炎病毒 （HCV）的非结构蛋白 5A（NS5A）是一种具有显着反式激活作用的病毒蛋白质。为了探索HCVNS5A病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因 ,我们应用抑制性消减杂交 （SSH）技术对于转染和未转染的肝母细胞瘤细胞系HepG2进行分析。研究结果将有助于阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 以HCVNS5A表达质粒pcDNA3 1（-）NS5A转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 1（-）为平行对照 ,提取mRNA并进行SSH分析。对于所获基因片段序列分析表明 ,其中之一为新型基因片段 ,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性 ,利用表达序列标签 （EST）序列的搜索和比对 ,进行电子拼接 ,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列 ,确定新型基因序列。结果 结果从HepG2细胞提取总RNA ,多聚酶链反应 （RTPCR ）技术扩增获得该新基因的全长序列 ,测序证实 ,命名为NS5ATP8在GenBank中注册 ,注册号为AF5 2 93 69。NS5ATP8基因的编码序列全长为 14 49（nt） ,编码产物由 483个氨基酸残基 （aa）组成。结论 HCVNS5A反式激活新型靶基因NS5ATP8筛选与克隆 ,进一步研究HCVNS5A反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础
成军,李克,王琳,陆荫英,刘妍,钟彦伟[10]（2004）在《丙型肝炎病毒非结构蛋白5A结合蛋白37小鼠同源基因的克隆化及结构分析》文中认为目的:克隆丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白5A（NS5A）结合蛋白37（NS5ABP37）的小鼠同源基因,为阐明小鼠NS5ABP37基因的生物学功能奠定基础,探索HCVNS5A蛋白与NS5ABP37蛋白之间的结合在慢性丙型肝炎的发病机制中可能的作用.方法:利用酵母双杂交系统3,以HCVNS5A蛋白作为诱饵,筛选肝细胞cDNA文库,首先获得HCVNS5A结合的人肝细胞蛋白的新的编码基因.利用生物信息学（bioinformatics）技术确定NS5ABP37的小鼠同源基因序列.利用GenBank在线分析软件,对小鼠NS5ABP37蛋白一级结构特点进行分析.结果:通过酵母双杂交技术获得了人NS5ABP37的编码基因.利用生物信息学技术确定了小鼠NS5ABP37的基因序列.利用分子生物学技术获得了小鼠的NS5ABP37的基因克隆,小鼠NSSABP37基因开放读码框架（ORF）为1488nt,编码产物由495aa组成.计算分子量为54583.67道尔顿,预测等电点（pI）为4.70.小鼠NS5ABP37与白细胞抗原相关（leukocyteantigenrelated,EAR）蛋白前体蛋白（LARproteinprecursor）同源.小鼠HCVNS5ABP37基因序列被美国核苷酸数据库GenBank收录,收录号为AY234860.结论:成功确定、克隆了小鼠的NS5ABP37基因序列,并证实与白细胞抗原相关蛋白前体蛋白具有一定的同源性.这一结果,为进一步阐明小鼠的NS5ABP37基因的功能,阐明HCV感染的发病机制奠定了坚实的基础.
二、筛选与克隆丙型肝炎病毒NS5A蛋白结合蛋白的基因（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、筛选与克隆丙型肝炎病毒NS5A蛋白结合蛋白的基因（论文提纲范文）
（1）m6A甲基化修饰调控牛病毒性腹泻病毒NS5A的表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 牛病毒性腹泻-粘膜病的研究进展 |
| 1.2.1 病原学 |
| 1.2.2 流行病学 |
| 1.2.3 BVDV引起的免疫反应 |
| 1.2.4 BVDV结构与功能 |
| 1.3 N~6-methyladenosine(m~6A)修饰 |
| 1.3.1 RNA修饰 |
| 1.3.2 m~6A修饰 |
| 1.4 病毒m~6A修饰的研究 |
| 1.4.1 m~6A修饰在RNA病毒感染中的影响 |
| 1.4.2 m~6A修饰在RNA病毒感染中的影响 |
| 1.5 研究的目的及意义 |
| 2 BVDV感染后影响m~6A甲基化酶和去甲基化酶的表达 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞和病毒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细胞培养与病毒增殖 |
| 2.2.2 细胞的RNA提取及反转录 |
| 2.2.3 PCR鉴定BVDV |
| 2.2.4 BVDV感染细胞后m~6A甲基化蛋白转录水平的检测 |
| 2.2.5 BVDV感染细胞后m~6A甲基化蛋白蛋白水平的检测 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 BVDV NADL株接种MDBK细胞结果 |
| 2.3.2 BVDV的PCR鉴定 |
| 2.3.3 m~6A甲基化蛋白相对荧光定量PCR结果 |
| 2.3.4 METTL3、METTL14、FTO Western blot结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 牛METTL3、METTL14、FTO真核表达载体的构建及鉴定 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 载体、细胞 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 细胞的RNA提取及反转录 |
| 3.2.3 牛METTL3、METTL14、FTO基因的克隆及分析 |
| 3.2.4 牛METTL3、METTL14、FTO蛋白真核表达载体的构建 |
| 3.2.5 293T细胞的转染 |
| 3.2.6 重组蛋白pcDNA3.0-METTL3、 pcDNA3.0-METTL14、 pcDNA3.0-FTOWestern blot的鉴定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 METTL3、METTL14、FTO基因的PCR扩增 |
| 3.3.2 重组质粒的酶切鉴定 |
| 3.3.3 重组蛋白的Western blot鉴定 |
| 3.3.4 METTL3、FTO蛋白生物信息学分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 牛METTL3、METTL14、FTO对 BVDV NS5A蛋白的影响 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞及质粒 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 重组质粒pcDNA3.1-NS5A的转化 |
| 4.2.2 重组质粒pcDNA3.1-NS5A的酶切鉴定 |
| 4.2.3 重组质粒pcDNA3.1-NS5A的鉴定 |
| 4.2.4 蛋白互作的预测 |
| 4.2.5 免疫共沉淀试验 |
| 4.2.6 质粒的共转染 |
| 4.2.7 质粒的电转 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 重组质粒pcDNA3.1-NS5A的鉴定 |
| 4.3.2 NS5A蛋白Western blot的鉴定 |
| 4.3.3 蛋白互作预测结果 |
| 4.3.4 通过Co-IP试验分析METTL3和NS5A的相互作用 |
| 4.3.5 Western blot分析NS5A与 METTL3、METTL14和FTO的关系 |
| 4.3.6 过表达METTL3对病毒复制的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 个人简历 |
（2）丙型肝炎病毒复制子新型构建方法的建立及基因3a、6a型病毒株耐药性的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 丙型肝炎病毒的流行病学 |
| 1.2 丙型肝炎病毒的基因型分布 |
| 1.3 丙型肝炎病毒的分子病毒学 |
| 1.3.1 丙型肝炎病毒的基因组结构 |
| 1.3.2 丙型肝炎病毒的生活周期 |
| 1.4 丙型肝炎病毒的研究模型 |
| 1.4.1 丙型肝炎病毒的假病毒模型 |
| 1.4.2 丙型肝炎病毒的亚基因组复制子模型 |
| 1.4.3 丙型肝炎病毒的细胞感染模型 |
| 1.4.4 丙型肝炎病毒的动物模型 |
| 1.5 丙型肝炎病毒直接抗病毒药物的发展 |
| 1.5.1 丙型肝炎病毒直接抗病毒药物的分类 |
| 1.5.2 直接抗病毒药物相关的耐药突变的总结 |
| 1.6 本课题研究背景 |
| 1.7 本课题研究目标 |
| 第二章 实验材料与试验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 蛋白抗体 |
| 2.3 HCV直接抗病毒药物 |
| 2.4 病人血清的来源及RNA的抽提 |
| 2.5 多规格孔板的细胞实验 |
| 2.6 复制子单克隆的分离 |
| 2.7 PCR体系 |
| 2.8 质粒回收与琼脂糖电泳产物回收 |
| 2.9 大肠杆菌感受态DH5α的制备与转化 |
| 2.10 酿酒酵母感受态W303 的制备与转化 |
| 2.11 质粒构建 |
| 2.12 TA平末端克隆与限制性内切酶 |
| 2.13 RNA抽提与反转录 |
| 2.14 HCV RNA的体外转录与转染 |
| 2.15 直接抗病毒药物敏感性的测试 |
| 2.16 免疫荧光 |
| 2.17 免疫印迹 |
| 2.18 HCV序列的生物信息学分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 丙型肝炎病毒亚基因组复制子新型构建方法的建立 |
| 3.1.1 丙型肝炎病毒复制子cDNA文库的构建 |
| 3.1.2 丙型肝炎病毒复制子细胞的建立 |
| 3.1.3 基因1b型病毒复制子细胞复制特点的研究 |
| 3.1.4 基因3a型病毒复制子细胞复制特点的研究 |
| 3.1.5 基因6a型病毒复制子细胞复制特点的研究 |
| 3.2 基因3a型丙型肝炎病毒亚基因组复制子耐药相关的研究 |
| 3.2.1 基因3a型复制子对直接抗病毒药物的敏感性研究 |
| 3.2.2 基因3a型复制子对NS3 抑制剂耐药机制的研究 |
| 3.2.3 基因3a型复制子NS3 抑制剂耐药位点D168Q稳定存在的机制研究 |
| 3.3 基因6a型丙型肝炎病毒对索磷布韦耐药机制的研究 |
| 3.3.1 基因6a型复制子索磷布韦耐药性的诱导 |
| 3.3.2 基因6a型复制子耐药型细胞克隆的特点分析 |
| 3.3.3 基因6a型丙型肝炎病毒索磷布韦耐药位点的鉴定研究 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 缩略词 |
| 作者简历 |
| 专业综述 |
| 参考文献 |
（3）NLRX1和Sam68调控丙型肝炎病毒复制机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 先天免疫应答概述 |
| 1.1.1 TLR受体 |
| 1.1.2 TLR信号传导通路 |
| 1.1.3 RLR受体 |
| 1.1.4 RLR信号传导通路 |
| 1.1.5 其他受体 |
| 1.1.6 HCV相关先天免疫反应 |
| 1.2 先天免疫调控因子 |
| 1.2.1 泛素化修饰 |
| 1.2.2 宿主蛋白对先天免疫的调控 |
| 1.2.3 病毒对先天免疫应答的调控 |
| 1.3 NLRX1 蛋白 |
| 1.4 PCBP2 蛋白 |
| 1.5 丙型肝炎病毒 |
| 1.5.1 丙型肝炎病毒简介 |
| 1.5.2 丙型肝炎病毒结构 |
| 1.5.3 丙型肝炎病毒研究进展 |
| 1.6 Sam68 蛋白 |
| 1.7 本课题设计思路 |
| 第2章 NLRX1 抑制HCV诱导的先天免疫应答 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 材料与试剂 |
| 2.2.2 仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 质粒构建 |
| 2.3.2 质粒的转染 |
| 2.3.3 细胞内总RNA的提取 |
| 2.3.4 逆转录PCR |
| 2.3.5 实时定量PCR(SYBR Green) |
| 2.3.6 细胞培养 |
| 2.3.7 细胞总蛋白的提取 |
| 2.3.8 蛋白免疫印迹(Western Blot) |
| 2.3.9 免疫荧光试验 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 HCV诱导NLRX1 表达 |
| 2.4.2 NLRX1 促进HCV复制 |
| 2.4.3 NLRX1 抑制HCV诱导的先天免疫应答 |
| 2.4.4 NLRX1 抑制RNA病毒诱导的先天免疫应答 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 NLRX1 促进MAVS发生K48 位依赖的泛素化降解 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 材料与试剂 |
| 3.2.2 仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 蛋白质免疫共沉淀 |
| 3.3.2 免疫印迹实验步骤 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 HCV促进NLRX1与MAVS相互作用 |
| 3.4.2 NLRX1 促进MAVS降解依赖于蛋白酶体途径 |
| 3.4.3 NLRX1 促进MAVS发生K48 依赖的多聚泛素化降解 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 NLRX1 利用PCBP2 降解MAVS |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 材料与试剂 |
| 4.2.2 仪器设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 质粒构建 |
| 4.3.2 免疫印迹实验步骤 |
| 4.3.3 免疫共沉淀实验步骤 |
| 4.3.4 实时定量PCR(SYBR Green) |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 NLRX1与PCBP2 相互作用 |
| 4.4.2 PCBP2 促进NLRX1 介导的MAVS泛素化降解 |
| 4.4.3 HCV促进PCBP2 降解MAVS |
| 4.5 小结 |
| 第5章 NLRX1 利用PCBP2 抑制HCV诱导的先天免疫应答 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 材料与试剂 |
| 5.2.2 仪器设备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 实时定量PCR(SYBR Green) |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 PCBP2 抑制HCV诱导的先天免疫应答 |
| 5.4.2 NLRX1与PCBP2 互助负调控HCV诱导的免疫印应答 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 Sam68 促进HCV复制 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验材料 |
| 6.2.1 材料与试剂 |
| 6.2.2 仪器设备 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 质粒构建 |
| 6.3.2 免疫印迹实验 |
| 6.3.3 免疫共沉淀实验步骤 |
| 6.3.4 实时定量PCR(SYBR Green) |
| 6.3.5 免疫荧光实验 |
| 6.3.6 双荧光素酶报告基因实验 |
| 6.3.7 体外转录(Ambion) |
| 6.3.8 电穿孔法转染RNA |
| 6.3.9 细胞质与细胞核分离实验 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.4.1 Sam68 升高HCV蛋白水平 |
| 6.4.2 Sam68 促进HCV复制 |
| 6.4.3 HCV诱导Sam68 由细胞核移位至细胞质 |
| 6.5 小结 |
| 第7章 Sam68 结合于HCV的5’非编码区第2 个茎环结构 |
| 7.1 前言 |
| 7.2 实验材料 |
| 7.2.1 材料与试剂 |
| 7.3 实验方法 |
| 7.3.1 质粒构建 |
| 7.3.2 免疫印迹实验 |
| 7.3.3 实时定量PCR(SYBR Green) |
| 7.3.4 RNA免疫共沉淀实验 |
| 7.3.5 蛋白质原核表达纯化 |
| 7.4 结果与讨论 |
| 7.4.1 Sam68 直接结合HCV基因组RNA |
| 7.4.2 Sam68 结合于HCV5'-UTR |
| 7.4.3 Sam68 结合HCV5′-UTR茎环结构2(SL2) |
| 7.4.4 Sam68的1至157 氨基酸结合于HCV基因组并促进病毒复制 |
| 7.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 攻读学位期间所发表的学术论文目录 |
| 致谢 |
（4）丙型肝炎病毒感染中异常表达的肝细胞糖复合物的相关研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一部分 HCV感染过程中异常表达的糖苷和糖蛋白的鉴定 |
| 一、实验材料 |
| 二、主要仪器 |
| 三、实验方法 |
| 四、实验结果 |
| (一) 确认HCVcc成功感染Huh7.5.1细胞 |
| (二) Huh7.5.1细胞感染HCVcc前后N-糖链的质谱分析 |
| (三) 凝集素芯片技术解析HCV感染过程中糖苷的变化以及结果验证 |
| (四) 凝集素LCA富集差异表达的糖蛋白以及候选糖蛋白的筛选与鉴定 |
| (五) Huh7.5.1细胞感染HCVcc后岩藻糖转移酶家族表达谱的变化 |
| (六) FUT8参与对HSP90B1和ANXA2蛋白糖基化修饰的调节 |
| 讨论 |
| 第二部分 FUT8在HCV感染过程中异常表达及其作用机制研究 |
| 一、实验材料 |
| 二、主要仪器 |
| 三、实验方法 |
| 四、实验结果 |
| (一) HCVcc感染增强FUT8的催化活性 |
| (二) FUT8特异性shRNA干扰质粒的构建、鉴定及表达 |
| (三) FUT8促进HCV的复制 |
| (四) FUT8在HCV感染过程中参与的信号通路的研究 |
| (五) FUT8通过激活PI3K/AKT信号通路促进细胞的增殖和病毒的复制 |
| (六) FUT8对抗病毒药物IFNα-2b的影响 |
| 讨论 |
| 第三部分 HCV感染过程中异常表达的TNNT1及其相关性研究 |
| 一、实验材料 |
| 二、主要仪器 |
| 三、实验方法 |
| 四、实验结果 |
| (一) HCVcc感染Huh7.5.1细胞后诱导细胞mRNA表达谱改变 |
| (二) Huh7.5.1细胞感染HCVcc后mRNA芯片结果验证 |
| (三) TNNT1特异性shRNA干扰质粒的构建、鉴定及表达 |
| (四) TNNT1过表达质粒的构建、鉴定及表达 |
| (五) TNNT1促进HCV的复制 |
| (六) TNNT1促进HCV感染细胞的增殖和细胞周期相关基因的表达 |
| (七) TNNT1与HCVcc感染Huh7.5.1细胞的MTA2结合 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间已发表的科研成果 |
| 后记 |
（5）科学研究的设计和方法中的科学性（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 研究基因转录水平主要考虑的是启动子的转录活性 |
| 2 肝炎病毒准种特点是一个不能忽视的问题 |
| 3结合蛋白和受体的区别 |
（6）小鼠和大鼠NS5ATP4同源基因序列的生物信息学分析（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 2结果 |
| 3讨论 |
（9）丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因8的克隆化研究（论文提纲范文）
| 材料与方法 |
| 一、NS5ATP8基因序列的确定 |
| 二、序列的分析 |
| 三、多聚酶链反应 (PCR) 扩增NS5ATP8基因 |
| 四、克隆目的片段 |
| 五、丙型肝炎病毒NS5A蛋白基因表达载体的构建 |
| 结 果 |
| 8基因序列及编码产物一级结构序列 |
| 讨 论 |
（10）丙型肝炎病毒非结构蛋白5A结合蛋白37小鼠同源基因的克隆化及结构分析（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1诱饵质粒载体的构建及酵母配合实验 |
| 1.2.2 小鼠HCV NS5ABP37同源基因的克隆化 |
| 2 结果 |
| 2.1小鼠HCV NS5ABP37同源基因的克隆化 |
| 2.2 人、小鼠HCV NS5ABP37蛋白一级结构序列的同源性比较 |
| 2.3小鼠HCV NS5ABP37同源基因保守结构位点的生物信息学分析 |
| 3 讨论 |
四、筛选与克隆丙型肝炎病毒NS5A蛋白结合蛋白的基因（论文参考文献）
- [1]m6A甲基化修饰调控牛病毒性腹泻病毒NS5A的表达[D]. 黄雯静. 黑龙江八一农垦大学, 2021(09)
- [2]丙型肝炎病毒复制子新型构建方法的建立及基因3a、6a型病毒株耐药性的研究[D]. 郭明哲. 中国科学院大学(中国科学院上海巴斯德研究所), 2019(07)
- [3]NLRX1和Sam68调控丙型肝炎病毒复制机制研究[D]. 覃煜雯. 湖南大学, 2019(07)
- [4]丙型肝炎病毒感染中异常表达的肝细胞糖复合物的相关研究[D]. 向田. 武汉大学, 2017(06)
- [5]科学研究的设计和方法中的科学性[J]. 成军. 世界华人消化杂志, 2004(07)
- [6]小鼠和大鼠NS5ATP4同源基因序列的生物信息学分析[J]. 成军,杨倩,刘妍,王建军,纪冬. 世界华人消化杂志, 2004(07)
- [7]HBV前-S1蛋白结合蛋白大鼠同源基因的克隆化[J]. 成军,董菁,张健,王建军,纪冬,刘妍,钟彦伟,王琳. 世界华人消化杂志, 2004(07)
- [8]HCBP6对HCV核心蛋白反式激活作用的影响[J]. 成军,李克,刘妍,王琳,陆荫英,钟彦伟. 世界华人消化杂志, 2004(04)
- [9]丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因8的克隆化研究[J]. 杨艳杰,成军,王春花,党晓燕,钟彦伟. 胃肠病学和肝病学杂志, 2004(01)
- [10]丙型肝炎病毒非结构蛋白5A结合蛋白37小鼠同源基因的克隆化及结构分析[J]. 成军,李克,王琳,陆荫英,刘妍,钟彦伟. 世界华人消化杂志, 2004(02)