HBc病毒样颗粒在筛选多功能单克隆抗体中的应用研究

论文摘要

目的:乙肝病毒核心蛋白可自我组装成病毒样颗粒（VLP）,HBc-VLP作为表位递呈系统可用于携带外源表位。除了应用于VLP疫苗和表位疫苗以外,VLP还可用于病毒颗粒的摄取,病毒药物活性以及树突状细胞（DCs）的抗原递呈功能等研究中。然而,我们发现一些商业化单克隆抗体并不能特异性识别HBc-VLP,同样也无法应用于细胞内病毒样颗粒的定位研究,于是我们不得不购买大量单抗以找到一种合适的,这一过程无疑费力又费钱。因次,要制备出一个HBc-VLP特异性多功能单克隆抗体以满足多种研究的不同需要。方法:①构建与表达HBV核心抗原:截短的HBc基因（aa1-144）通过PCR扩增而来,PCR产物经酶切后,转入表达载体pET-28a。阳性质粒转染BL21（DE3）大肠杆菌菌株,用IPTG诱导;②快速纯化重组HBc蛋白:离心获得湿重为9克的菌体,重悬加入溶菌酶后超声破菌获得包含体。将包含体加入10ml变性缓冲液（50mM Tris-HCL,pH 8.0和0.1M尿素）,不能溶解的成分通过离心（30 min 12000g）去除。用复性缓冲液稀释至2mg/ml的浓度。复性蛋白溶液用双蒸水（pH6.0）透析以去除残留的尿素。并用SDS-PAGE确定其纯度;③电镜分析所制备的VLP;④制备抗HBc-VLP单克隆抗体:用HBc-VLP（aa1-144）作为免疫原来免疫BALB/c雌鼠。经过几次免疫后,将抗体滴度高的BALB/c鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。先用ELISA筛选,再进行western印迹分析以进一步筛选,获得HBc-VLP特异性抗体;⑤鼠单核-巨噬细胞系RAW264.7的吞噬作用的检测;⑥利用共聚焦激光扫描显微镜对HBc-VLP表位疫苗的摄取过程进行观察;⑦HepG2.2.15细胞中活HBV的观察:将HepG2.2.15细胞接种于玻片上并培养,以观察先前所筛选的阳性单抗是否能与自然病毒颗粒反应。HepG2细胞作为阴性对照。结果:①成功构建了pET-28a-HBc（aa1-144）,经SDS-PAGE分析,其所表达的目的蛋白分子量为19kDa;②经western印迹分析验证该目的蛋白的确具备HBc抗原的免疫原性;③0.1M尿素所溶解的HBc蛋白可形成病毒样颗粒;经超纯水透析后的HBc-VLP的结构更加规则统一;④用HBc-VLP作为免疫原来免疫BALB/c雌鼠通过ELISA和western印迹分析筛选到5个HBc-VLP特异性抗体;⑤筛选到3个可与被APC摄取的HBc-VLP相结合的特异性单抗。这三个单抗的编号分别为3H2D7-F6,1H7D7-D2和388E6-D3;⑥利用HepG2.2.15细胞系筛选到1个单抗能特异性结合自然状态下的HBc颗粒,此单抗编号为3H2D7-F6。结论:①以截短的HBc-VLP骨架作免疫原,以此表位递呈系统为筛选平台,最终筛选出1个可用于鉴定HBc-VLP,嵌合体HBc-VLP疫苗和细胞内乙肝病毒衣壳蛋白的抗体。该抗体具备多功能抗HBc-VLP作用,应用此多功能单抗可节约大量经费。②构建与表达的目的蛋白具有HBc抗原的免疫原性。③0.1M尿素所溶解的HBc蛋白可形成病毒样颗粒。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩略词
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 攻读学位期间主要研究成果