嗜酸氧化亚铁硫杆菌启动子探针载体的构建及petⅡ启动子的分离鉴定

论文摘要

启动子是基因表达调控的重要顺式元件,也是基因工程表达载体的一个重要元件。启动子的克隆对于构建基于工程载体,表达目的蛋白有着重要的意义。本论文中,为了研究原核启动子结构与功能。以pSV-β-galactosidase质粒为骨架,通过定点突变的方法引入一个新的BstBI单酶切位点,构建了能在大肠杆菌（Escherichia coli）中正常复制及表达的pSVB启动子探针载体。嗜酸氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillus ferrooxidans）中由cycA2,sdrA2,petA282C2等基因组成的petⅡ操纵子编码一个电子传递bcl复合体,位于cycA2基因编码区上游序列具有启动子结构特征。本文利用PCR的方法将A.ferrooxidans菌cycA2基因上游DNA片段克隆至pSVB启动子探针载体β-半乳糖苷酶基因上游,替代其原有的启动子（gpt启动子）,得到重组质粒pAP2。将质粒导入大肠杆菌（Escherichia coli）进行表达,通过检测β-半乳糖苷酶活性,来鉴定启动子活性强弱。酶活性分析表明,A.ferrooxidans菌cycA2基因上游DNA片段具有显著的启动子活性,同时也说明此启动子探针载体可以用于克隆并鉴定源自A.ferrooxidans菌的重要功能基因的潜在启动子区。进一步对petⅡ启动子区序列分析发现,在其cycA2基因编码区上游-95bp～-90bp处（序列为“TTGATA”）和-59bp～-54bp（序列为“TATGCT”）处存在两个符合原核生物启动子核心元件特征的位点,即类似-35区和-10区的序列。采用定点突变技术,在-95bp～-90bp处将其第一个碱基由“T”突变为“G”,结果导致启动子活性骤降至野生型的15%左右;而将-59bp～-54bp序列第一个碱基由“T”突变为“C”,则使启动子活性降至野生型的59%。上述结果表明:这两个区域是petⅡ启动子的关键位点,确定为启动子的-35区和-10区。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 第一章 绪论
• 1.1 A.forrooxidans菌铁硫代谢系统介绍
• 1.1.1 A.ferrooxidans菌硫氧化系统
• 1.1.2 A.ferrooxidans菌亚铁氧化系统
• 1.1.3 petII操纵子
• 1.2 启动子研究方法概述
• 1.2.1 启动子的结构和特点
• 1.2.2 启动子的识别方法
• 1.2.3 启动子克隆的方法
• 1.2.4 启动子研究的方法
• 1.3 课题的研究目的与研究内容
• 1.3.1 依据和目的
• 1.3.2 论文的主要研究内容
• 1.3.3 论文课题受资助情况
• 第二章 启动子探针载体的构建
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种和质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 质粒抽提试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 感受态细胞制备
• 2.2.2 质粒提取
• 2.2.3 定点突变PCR
• 2.2.4 PCR扩增产物的鉴定
• 2.2.5 酶切PCR产物及载体
• 2.2.6 载体和目的片段连接反应
• 2.2.7 转化
• 2.2.8 目的载体的筛选与鉴定
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 质粒突变及测序分析
• 2.3.2 启动子探针载体pSVB功能分析
• 2.4 本章小结
• 第三章 PETII启动子的克隆与活性分析
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌种与质粒
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 酶活性分析试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 A.ferrooxidans基因组DNA提取
• 3.2.2 petII非编码区扩增
• 3.2.3 PCR产物鉴定及双酶切
• 3.2.4 探针载体和目的片段连接反应
• 3.2.5 转化
• 3.2.6 阳性克隆的筛选
• 3.2.7 β-半乳糖苷酶活性测定
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 petII非编码区测序
• 3.3.2 β-半乳糖苷酶表达水平分析
• 3.4 本章小结
• 第四章 PETII启动子核心区突变研究
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌种与质粒
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 银染试剂
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 A区定点突变体构建
• 4.2.2 B区定点突变体构建
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 petII启动子分析与核心区突变
• 4.3.2 突变对启动子活性的影响
• 4.4 本章小结
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 研究成果