鸡骨骼肌硒蛋白W对不同硒水平的响应及其功能初探

论文摘要

硒（Se）是人和动物必需微量元素,在禽类的生长发育、繁殖、免疫功能及抵抗疾病等方面发挥着重要生物学功能。硒主要以硒蛋白的形式存在并发挥其生物学作用。在正常动物中,硒蛋白W（Selenoprotein W,SelW）是一种骨骼肌和心肌中含量丰富的硒蛋白,而在患有缺硒相关疾病的动物肌肉中检测不到,后来发现机体含硒状态与骨骼肌中SelW的变化密切相关,而且SelW与肌肉的代谢和疾病发生可能相关。目前关于SelW的研究主要集中在哺乳动物（包括灵长类,啮齿类,绵羊,猪等）,对SelW蛋白家族生物学功能的研究正处于起步阶段,而其在禽类肌肉系统的发育中的作用及其基因表达调控的研究还未见报道。本研究应用无菌细胞培养技术建立可靠的鸡胚成肌细胞原代培养方法并通过细胞免疫荧光技术对培养的细胞进行纯度鉴定;然后以雏鸡和鸡胚成肌细胞为试验对象,采用定量PCR法,测定不同硒水平对鸡骨骼肌（包括翅肌、胸肌和腿肌）和成肌细胞中SelW转录水平的影响,同时通过利用RNAi技术干扰成肌细胞SelW基因水平,并检测SelW干扰对成肌相关调节因子（Myf-5、Myogenin、MRF4和P21）基因水平、细胞周期和细胞内总GSH含量的影响,结果表明:1.通过I型胶原酶消化,Percoll分离液进一步纯化的鸡胚成肌细胞,在增殖培养液中增殖旺盛;在分化培养液中分化良好,促进细胞相互融合并形成肌管。Desmin和α-Sacromeric Actin免疫细胞化学染色在成肌细胞呈阳性反应,阳性率达到95%以上,其高纯度成肌细胞的获得为后续成肌细胞的加硒反应和敲除试验奠定基础。2饲料中不同硒浓度(0.033 mg·kg-1、0.150 mg·kg-1、1.500 mg·kg-1)能够影响不同日龄（1 d、15 d、25 d、35 d）雏鸡肌肉组织中硒含量和SelW的转录水平,不同鸡肌肉组织对硒含量的敏感性和快速应答能力不同,其中胸肌和腿肌对硒含量变化比较敏感;同时,培养液中不同含硒量（终浓度10-8M、10-7M、10-6M）也能够调节体外培养鸡胚成肌细胞SelW的转录水平,获得与体内试验类似的结果。提示SelW在鸡肌肉组织代谢中有一定的作用。3.本试验成功将Stealth RNA（S-RNA）转染到原代培养的鸡胚成肌细胞中,最适条件是六孔板每孔加入30 nM的S-RNA和3.0μL的LipofectamineTM RNAiMAX,转染效率较高;成功筛选出高效鸡SelW的干扰序列SelWStealth（268）,成肌细胞中SelW mRNA表达水平降低至对照组的20%;并发现通过干扰mRNA开放阅读框（ORF）以外的非翻译区中的硒代半胱氨酸插入元件（SECIS）区域同样能获得满意的干扰效果。4.在SelW RNAi后12 h、24 h、36 h和48 h时,对成肌细胞中成肌分化相关因子表达水平进行检测,发现Myogenin和MRF4 mRNA分别于12 h和36 h低于对照组,P21在24 h和48 h时低于对照组（P < 0.05）。提示SelW参与调节成肌细胞分化的进程;同时,Myf-5转录水平显著降低,成肌细胞的细胞周期检测发现G0/G1期细胞比例增多,G2/M期和S期的细胞比例下降,推测细胞的增殖能力也受到SelW干扰的影响。5.在获得最大SelW干扰效率的时间点（干扰后24 h）,成肌细胞内的GSH含量也显著降低,提示细胞的抗氧化能力减弱。

论文目录

• 摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 硒与硒蛋白W
• 1.1.1 硒的作用
• 1.1.2 硒蛋白W
• 1.2 RNA 干扰
• 1.2.1 RNAi 的发现
• 1.2.2 RNAi 的基本原理
• 1.2.3 RNAi 现象的主要特征
• 1.2.4 Stealth RNA
• 1.3 骨骼肌发育与再生
• 1.3.1 Myo D 家族生肌调节因子
• 1.3.2 MRFs 与其他因子共同实现成肌特异性
• 1.3.3 MRFs 在成肌不同阶段的作用
• 1.3.4 成肌细胞的最后分化
• 1.4 试验的目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 主要仪器与试剂
• 2.1.1 主要仪器
• 2.1.2 主要试剂及配制
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 鸡胚成肌细胞的原代培养及鉴定
• 2.2.2 不同硒浓度对雏鸡和鸡胚成肌细胞的处理
• 2.2.3 qPCR 对目的基因mRNA 水平检测方法的建立
• 2.2.4 SelW RNAi 条件的优化及引物的筛选
• 2.2.5 成肌细胞SelW RNAi 试验
• 2.2.6 试验数据的统计与分析
• 3 结果
• 3.1 鸡胚成肌细胞的原代培养及纯度鉴定
• 3.1.1 鸡胚成肌细胞的形态学观察
• 3.1.2 鸡胚成肌细胞增殖生长曲线
• 3.1.3 鸡胚成肌细胞的免疫细胞化学染色鉴定
• 3.2 qPCR 对目的基因mRNA 水平检测方法的建立
• 3.2.1 总RNA 的抽提结果的鉴定
• 3.2.2 SelW、Myf-5、Myogenin、MRF4、P21 及β-Actin 基因qPCR 方法的鉴定
• 3.3 硒对雏鸡肌肉组织SelW 转录水平影响的检测结果
• 3.3.1 硒对雏鸡翅肌组织中硒浓度和SelW mRNA 表达水平影响的检测结果
• 3.3.2 硒对雏鸡胸肌组织中硒浓度和SelW mRNA 表达水平影响的检测结果
• 3.3.3 硒对雏鸡腿肌组织中硒浓度和SelW mRNA 表达水平影响的检测结果
• 3.4 硒对鸡胚成肌细胞SelW 转录水平影响的检测结果
• 3.5 SelW RNAi 条件的建立及引物的筛选结果
• 3.5.1 S-RNA 序列的BLAST 比对结果
• 3.5.2 S-RNA 的转染效率
• 3.5.3 SelW S-RNA 干扰引物的筛选
• 3.6 成肌细胞SelW RNAi 试验结果
• 3.6.1 SelW RNAi 后成肌细胞SelW 转录水平的检测结果
• 3.6.2 SelW RNAi 后MRFs 和P21 基因表达水平的检测结果
• 3.6.3 SelW RNAi 后细胞总GSH 含量、细胞周期的检测结果
• 4 讨论
• 4.1 鸡胚成肌细胞的原代培养及鉴定
• 4.1.1 肌成肌细胞的分离与纯化
• 4.1.2 骨骼肌成肌细胞体外培养及生长特性
• 4.1.3 分子水平骨骼肌成肌细胞的鉴定
• 4.2 硒对雏鸡肌肉组织硒浓度和SelW 转录水平的影响
• 4.3 硒对鸡胚成肌细胞SelW 转录水平的影响
• 4.4 SelW RNAi 条件的建立和干扰引物的筛选
• 4.4.1 S-RNA 的设计
• 4.4.2 RNAi 中的转染效率的优化
• 4.4.3 SelW 基因S-RNA 干扰引物的筛选
• 4.5 SelW RNAi 对鸡胚成肌细胞生长分化的影响
• 4.5.1 RNAi 对成肌细胞SelW 表达的影响
• 4.5.2 RNAi 对成肌细胞成肌调节因子表达的影响
• 4.5.3 SelW RNAi 对成肌细胞细胞周期的影响
• 4.5.4 SelW RNAi 对成肌细胞GSH 含量的影响
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文