杨国安王宏坤葛华陈鹏（内蒙古包头医学院第一附属医院中心实验室014010）
【中图分类号】R714【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2011）33-0078-02
【摘要】目的探讨FISH技术在产前诊断中的应用前景。方法应用国产探针(CSP18/CSPX/CSPY探针组和GLP13/GLP21探针组)对50例羊水中的细胞进行检测,从而判断胎儿13、18、21、X和Y染色体的数目有无异常，同时与50例羊水染色体培养结果进行对比。结果严格按照实验流程操作,50例羊水的FISH均检测成功，与胎儿羊水染色体核型分析的结果相比较,准确率为100%。但部分FISH检测结果中出现少量带有异常杂交信号的核。结论FISH技术相比羊水培养具有时间周期短，准确率高等特点，具有重要的应用价值，但并不能完全取代羊水培养在产前诊断中的作用。
【关键词】荧光原位杂交产前诊断羊水
【Abstract】ObjectiveTostudyapplicationoffluorescenceinsituhybridization(FISH)technologyinprenataldiagnosis.MethodsApplyingnationalprobe(probegroupCSP18/CSPX/CSPYandprobegroupGLP13/GLP21)todetectfiftyamnioticfluidcells,thendecidingwhetherthenumbersofchromosomal13,18,21,X,Yarenormal,andcomparingwithconsequenceoffiftyamnioticfluidcellculture.ResultsAccordingtoexperimentflow-sheetstrictly,fiftFISHdetectsaresuccessful,anditsaccuracyrateis100%comparedwithconsequenceoffiftyamnioticfluidchromosomalkaryotypeanalysis.ButpartofFISHdetectsappearedfewhybridizationsignal.ConclusionFISHtechnologyhasafewfeaturesincludingshorttimecycleandhighaccuracyratecomparedwithamnioticfluidculture.AlthoughFISHhasimportantapplicationvalue,itcant’ttotallydisplaceeffectofmnioticfluidcultureinprenataldiagnosis.
【Keywords】fluorescenceinsituhybridizationprenataldiagnosisamnioticfluid
我国计划生育政策执行30多年来，人口数量得到了显著控制，目前的计生工作重点已经从单纯的控制人口数量转变到提高人口素质。产前诊断作为出生缺陷干预的重点内容近年来发展迅速。目前针对胎儿的产前诊断主要采用羊水培养观察染色体数目及形态结构的异常，这种方法能够准确诊断胎儿的染色体病，但此类方法技术含量高，得到诊断结果所需的时间长。因此临床要求更便捷、准确、快速的诊断方法便应运而生了。
染色体荧光原位杂交（FISH）技术不仅可用于中期分裂相，还可在间期细胞显示杂交信号，因此，可以用于未培养的细胞,能很快得出诊断结果[1-3]。本文介绍了FISH技术在产前诊断中的应用。
1资料与方法
1.1研究对象
选择2008年5月-2010年10月在我院和内蒙古妇幼保健医院妇产科就诊的唐氏筛查高危孕妇50例，年龄26-45岁，平均年龄32.04岁；孕周14-20周，平均孕周18.4周。全部为唐氏筛查检测高危。高龄（≥35岁）孕妇12例。孕中期妇女先进行唐氏综合症筛查实验，筛查高危结果的孕妇建议进行羊水采集平行作羊水细胞培养和FISH检测。用22号腰穿针行羊膜腔穿刺抽取羊水30ml分成两份，10ml用于FISH检测，20ml用于羊水染色体培养[4]。
1.2所用仪器、试剂
所用仪器包括奥林巴斯BX51型荧光显微镜，FISH图像分析系统，37℃二氧化碳培养箱等。试剂为国产荧光原位杂交探针试剂盒由北京金菩嘉医疗科技有限公司提供。
1.3FISH检测
采集到的羊水立即进行样本玻片制备及预处理，接着进行样本制备及变性，同时准备探针混合物并变性，然后使探针与样本杂交，最后玻片洗涤后进行结果观察。
采集到的羊水立即离心后取上清，加固定液固定后用细胞混悬液滴片，在室温下老化过夜。老化后的破片在室温下于0.1MHCL溶液中浸泡玻片7—10分钟；前后均用2×SSC（PH7.0）溶液中漂洗玻片2次，每次5分钟；经酒精梯度洗脱，在于74℃，70%的甲酰胺/2×SSC中变性，洗脱，干燥后致46℃烤片机预热。将装有探针混合物的试管置于73±1℃水浴箱中变性5分钟，将10ul变性后的探针混合物滴于玻片杂交区域，立即加盖盖玻片，用树脂胶封片，将玻片置于预热的湿盒中，42℃保温箱中过夜杂交。移去盖玻片，立即将玻片置于盛有50%甲酰胺/2×SSC溶液瓶中，洗涤玻片3次；将玻片先后置于盛有2×SSC溶液和2×SSC/0.1%NP-40溶液瓶中，洗涤玻片；最后将玻片室温浸泡在70%乙醇中，3分钟后取出玻片，暗处自然干燥玻片。将15ulDAPI复染剂滴加于杂交区域位置，立即盖上盖玻片。暗处放置10—20分钟后，在荧光显微镜下选用合适的滤光片组观察玻片。
2结果
所有50例样本羊水培养和FISH检测均成功，50例样本中核型分析49例正常胎儿，1例21三体，平均出报告时间为3周。FISH检测为49例正常，1例21体，平均出报告时间为3天。两种试验方法所检测的结果一致。（见表1）
表1FISH与核型分析一致性比较
3讨论
出生缺陷严重制约社会发展，影响家庭与个人幸福。70%的出生缺陷是遗传因素所致，其中染色体非整倍体异常最常见。染色体异常疾病尚无有效治疗方法，因此开展产前诊断及早准确干预，成为降低染色体异常所致出生缺陷的主要途径。传统的细胞遗传学方法即染色体核型分析技术需细胞培养,周期长,人工消耗大，且不能检测染色体微缺失，制约了产前诊断的开展。
荧光原位杂交技术（fluoresenceinsituhybirdization,FISH）是一种将分子生物学(探针)与细胞遗传学(染色体)结合，检测染色体异常的新技术。通过荧光标记的染色体区带特异性的DNA探针与分裂期或间期细胞原位杂交，于荧光显微镜下观察，即可检测染色体畸变。与传统的细胞遗传学方法相比，其优势在于:(1)无需细胞培养，间期细胞即可用于杂交分析。(2)检测时只需计数间期细胞核上不同的杂交点，比传统的核型分析操作简单。(3)与核型条带分析方法相比,运用特定探针检测更敏感,更具特异性。特别是对染色体微小片段异常的检测，更有针对性。也可检测和定性标记染色体。因此非常适用于临床染色体异常疾病的产前诊断。目前在欧美发达国家应用产前诊断检测染色体异常占30%-40%[5,6]。
13、18、21、与X、Y染色体的非整倍体异常在染色体病导致出生缺陷的患儿中所占比例为80%-90%[7]。通过这五个DNA探针进行检测，可以诊断出大部分染色体病导致的出生缺陷儿。在本研究中，运用检测技术发现1例21-三体综合症,与细胞遗传学检测方法结果一致。
FISH方法作为一种快速产前诊断方法,可极大缓解受试者在等待结果中产生的忧虑和不安情绪。目前FISH技术虽在我国尚未普及,但鉴于技术对于产前诊断工作的重要临床价值,可以预见,在不久将来,这一方法会迅速推广,极大促进我国产前诊断事业发展,降低出生缺陷。
4结论
FISH技术是一项成熟、可靠、快速可行的技术，可以应用于临床的产前诊断。对于最常见的五种染色体数目异常情况的检测其成功率和准确率与细胞遗传学相同。相对于细胞遗传学诊断方法，FISH具有取材少，简便，出报告快，结果分析客观等优点。
参考文献
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[3]KlingerK,LangesG,ShookD,etal.Rapiddetectionofchromosomeaneuploidiesinunculturedamniocytesbyusingfluorescenceinsituhybridization(FISH)[J].AmJHumGenet,1992,51(1):55-65.
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[6]WrittersIetal.Rapidprenataldiagnosisoftrisomy21in5049consecutiveunculturedamnioticfluidsamplesbyfluorescenceinsltuhybridization(FISH)[J].PrenatDiagn.2002,22:29-33.
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