酵母双杂交筛选孕激素受体相互作用蛋白质及其功能的研究

论文摘要

PR（progesterone　receptor）,是核受体家族中的重要转录因子。分A、B两种亚型,它们分别是由一条单基因通过两个不同的起始密码子转录而成,在乳腺的发生发展以及乳腺癌的增生过程中发挥了重要作用。相对于PRA 而言,PRB 有更强的转录活性,其可以调控P21,c-myc,SOX4 等许多重要的靶基因。有研究表明,缺失了PR 基因的小鼠不仅不能自发排卵,而且还严重地限制了乳腺的发育。　　为了进一步研究PR在乳癌发生发展过程中的信号通路,我们采用酵母双杂交技术,以hPRB 的不同结构域作为诱饵,对人乳腺文库进行筛选,寻找与之相互作用的蛋白质,为进一步研究hPRB的功能提供新的线索。结果如下: 1. 运用标准PCR 方法成功扩增出了目的基因片段:AF3,　IF,　AF1-DBD,　AF2,并正确插入到了pGBKT7 载体的特定位置,通过测序保证了读码框的一致性。　2. 将pGBKT7-AF3,pGBKT7-IF,pGBKT7-AF1-DBD,pGBKT7-AF2转化入酵母细胞后,提取蛋白质,进行western　blotting　检测,分别正确地表达了相应的蛋白质,且蛋白质的含量足够进行酵母双杂交筛选。　3. 通过自身转录激活测试系统测试,结果表明,在IF,AF1-DBD,AF2,AF3 中,除去AF3 片段有自身转录激活活性,其余的皆没有自身转录激活活性,可以进行酵母双杂交筛选。4.　完成了大量的筛选验证工作,并首次从人乳腺文库中成功获取了与诱饵蛋白质相互作用的蛋白质PIAS3,为下一步研究工作做准备。5.　成功地从人乳腺文库中钓取了PIAS3 基因,并测序正确。6.　成功地将PIAS3 基因克隆至原核表达载体PGEX-KG 以及真核表达载体PXJ40-HA 上,并成功地表达出融合的原核蛋白及真核蛋白质。7. 成功地构建了孕激素受体PRB 的真核表达载体并表达出相应的蛋白质。8. 成功地建立了孕激素受体的转录激活活性系统。9. 发现了孕激素通过孕激素受体可以影响到肿瘤细胞的周期变化。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 文献综述
• 第一章 孕激素受体的研究进展
• 1. hPR的结构特性与功能研究
• 2. hPR的定位分布与表达
• 3. hPR与生殖的关系及其意义
• 4. hPR与肿瘤的关系及其意义
• 5. hPR表达的调控机制
• 实验部分
• 第二章 诱饵质粒的构建、鉴定与表达
• 材料与方法
• 2.1 材料及来源
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 主要试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 pGBKT7/AF3, IF, AF1-DBD, AF2 表达载体的构建
• 2.2.2 诱饵蛋白质在酵母中的表达
• 结果与讨论
• 小结
• 第三章 酵母双杂交技术筛选与hPR-B 相互作用的蛋白质
• 材料与方法
• 3.1 材料及来源
• 3.1.1 菌株与质粒
• 3.1.2 主要试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 文库的扩增
• 3.2.2 自身转录激活活性的检测
• 3.2.3 酵母双杂交筛选与hPRB 相互作用蛋白
• 3.2.4 阳性克隆的鉴定
• 3.2.5 质粒的提取
• 3.2.6 重复鉴定及测序比对
• 结果与讨论
• 小结
• 第四章 筛选到的基因cDNA序列的钓取及克隆表达
• 材料与方法
• 4.1 仪器、材料及试剂
• 4.1.1 菌株和质粒
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 细胞培养试剂
• 4.1.4 抗体
• 4.1.5 大型仪器
• 4.2 方法
• 4.2.1 PIA53 基因的钓取和克隆的构建
• 4.2.2 PIA53 与GST融合蛋白质在大肠杆菌中的表达
• 4.2.3 PIA53 在真核细胞中的表达
• 结果与讨论
• 小结
• 第五章 孕激素受体（PR）转录激活系统的建立及对细胞周期的影响
• 材料与方法
• 5.1 材料
• 5.1.1 细胞株、质粒
• 5.1.2 主要试剂及仪器
• 5.2 方法
• 5.2.1 孕激素受体（PRB）真核表达载体的构建及表达鉴定
• 5.2.2 孕激素受体PRB 转录活性测试分析系统的建立
• 结果与讨论
• 小结
• 总结
• 参考文献
• 作者简介
• 致谢