薯蓣炭疽病病原菌分离鉴定及抑菌制剂的筛选

论文摘要

参薯（Dioscorea alata L.）、淮山（Dioscorea opposita Thunb.）是薯蓣科薯预属单子叶缠绕性藤本植物。全世界薯蓣科有10属约650种,而薯蓣属全世界约有600种之多,在我国南方,以参薯和淮山最为常见。然而,随着种植技术的不断发展,种植面积日益扩大,病害的发生频数也随之增加,其中以炭疽病为最严重的病害。它所造成的危害已成为薯蓣种植、生产的重要限制因子。因此,炭疽病的研究对今后薯蓣品种的选育、高产栽培和管理等方面提供理论依据具有重要意义。本研究通过对多个地区的病害调查,并采集了多份感病种质对炭疽病进行了分离、鉴定及其抗病性研究,得出以下主要结论：1、对薯蓣资源圃所种植的约300份材料进行了两年的炭疽病病害跟踪调查。统计发现：两年的调查数据存在一定的差异。2、采用组织块分离法从采集的样品中分离得到29株炭疽病病原菌。并采用4℃斜面和-20℃20%甘油两种方法将29株病原菌保存。3、对所分离的病原菌进行ITS分析以及ISSR分子标记。ITS分析表明：29株菌株均为胶孢炭疽菌；通过对100条引物筛选,得到12条扩增条带多、重复性好、条带清晰的引物,并对29株菌株进行ISSR分子标记分析,其遗传相似系数的变化范围为0.5437-0.9187。标记结果并没有按照地区或材料将其划分,说明病原菌在所采样区域没有地域性,也没有材料专化性。但是ITS序列分析与ISSR分子标记具一定的关联性。4、薯蓣抗炭疽病种质筛选。通过离体接种的方法,将参薯和淮山共计79份种质进行抗病测试,筛选出一批抗病性较好的种质。5、农药筛选以及生防菌的筛选。选用11种常见的化学农药进行筛选评价,结果表明：福.福锌、多菌灵、甲霜锰锌、代森锰锌、百菌清、甲基托布津、代森锌对炭疽病病原菌都具有一定的抑制效果,其中多菌灵效果最好；福福锌、甲霜锰锌、代森锰锌效果次之；扑海因、氢氧化铜和丙环唑对该病原菌没有抑制作用。通过平板对峙筛选实验,筛选得到一株编号为30104的土壤放线菌,对所分离的炭疽病病原菌具有一定抑制作用,其抑菌带大小在2.2cm左右,抑菌率约为50%。6、对菌株30104进行发酵实验,采用发酵液和提取抗生素两种方法对病原菌进行了抑制效果评价,发现其对该病原菌均具有良好的抑制效果。并对该菌株进行了16S rDNA系列分析,将该菌株鉴定为链霉菌。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 薯蓣植物简介
• 1.2 薯蓣植物病害研究进展
• 1.3 薯蓣植物炭疽病发病特点及其规律
• 1.4 炭疽病病原菌的鉴定
• 1.4.1 炭疽病分类研究
• 1.4.2 炭疽病分子分类研究
• 1.4.2.1 ITS rDNA序列差异分析
• 1.4.2.2 RFLP标记技术
• 1.4.2.3 RAPD标记技术
• 1.4.2.4 SSR标记技术
• 1.4.2.5 ISSR标记技术
• 1.5 抗病育种研究
• 1.6 化学农药使用情况及其薯蓣病害防治方法
• 1.7 生物防治研究
• 1.7.1 生防菌的应用概述
• 1.7.2 土壤生防菌的研究与利用
• 1.8 本研究的目的和意义
• 1.9 技术路线
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验植物材料
• 2.1.2 培养基
• 2.2 仪器与试剂
• 2.2.1 仪器与试剂
• 2.2.2 溶剂配置
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 病害调查并统计
• 2.3.2 病体样品采集
• 2.3.3 病原菌的分离与保存
• 2.3.4 病原菌的回接验证
• 2.3.4.1. 病原菌孢子培养
• 2.3.4.2 离体叶片接种回验
• 2.3.5 病原菌的鉴定
• 2.3.5.1 菌株的ITS系列差异分析
• 2.3.5.1.1 Chelex-100法提取菌株DNA
• 2.3.5.1.2 rDNA-ITS扩增
• 2.3.5.1.3 ITS测序分析
• 2.3.5.2 菌株的ISSR-PCR标记
• 2.3.5.2.1 改良的CTAB法提取菌株DNA
• 2.3.5.2.2 ISSR引物筛选
• 2.3.5.2.3 ISSR-PCR扩增
• 2.3.5.2.4 扩增条带统计
• 2.3.5.2.5 NTSYSpc2.10y软件聚类分析
• 2.3.6 薯蓣抗炭疽病种质筛选
• 2.3.6.1 参试的薯蓣材料
• 2.3.6.2 接种方法和统计方法
• 2.3.7 农药筛选以及生防菌的筛选
• 2.3.7.1 农药筛选
• 2.3.7.1.1 病原菌孢子培养
• 2.3.7.1.2 农药配制
• 2.3.7.1.3 农药筛选
• 2.3.7.2 放线菌筛选以及效果评价
• 2.3.7.2.1 放线菌筛选
• 2.3.7.2.1.1 放线菌来源
• 2.3.7.2.1.2 放线菌活化
• 2.3.7.2.1.3 放线菌的筛选
• 2.3.7.2.2 筛选放线菌效果评价
• 2.3.7.2.2.1 制取菌株发酵液
• 2.3.7.2.2.2 发酵液中抗生素提取
• 2.3.7.2.2.3 抗生素活性检测
• 2.3.8 生防菌分子鉴定
• 2.3.8.1 放线菌DNA提取
• 2.3.8.2 16SrDNA的PCR扩增
• 2.3.8.3 16S rDNA测序
• 2.3.8.4 系统发育树的构建
• 3 结果与分析
• 3.1 病害调查统计
• 3.2 炭疽病病体样品采集
• 3.3 炭疽病病原菌的分离与保存
• 3.4 病原菌的回接验证
• 3.5 病原菌的ITS标记以及ISSR标记
• 3.5.1 菌株的ITS系列分析
• 3.5.1.1 菌株的DNA提取
• 3.5.1.2 菌株rDNA-ITS序列扩增
• 3.5.1.3 目的片段序列测定和比对分析
• 3.5.2 菌株的ISSR标记分析
• 3.5.2.1 菌株DNA提取
• 3.5.2.2 ISSR引物筛选
• 3.5.2.3 ISSR-PCR扩增结果
• 3.5.2.4 扩增产物的多态性分析
• 3.5.2.5 NTSYSpc2.10软件聚类分析
• 3.6 薯蓣抗炭疽病种质筛选
• 3.7 农药筛选与生防菌筛选
• 3.7.1 农药筛选
• 3.7.2 放线菌筛选以及效果评价
• 3.7.2.1 放线菌筛选
• 3.7.2.2 放线菌30104抗菌效果评价
• 3.7.3 放线菌30104的分子鉴定
• 3.7.3.1 菌株30104 16SrDNA-PCR扩增
• 3.7.3.2 16S rDNA序列系统发育树构建
• 4 讨论与结论
• 4.1 讨论
• 4.1.1 病害调查
• 4.1.2 病原菌的分离、保存与验证
• 4.1.3 病原菌的ITS系列分析以及ISSR分子标记
• 4.1.3.1 病原菌的ITS系列分析
• 4.1.3.2 ISSR分子标记
• 4.1.3.3 ITS序列分析与ISSR分子标记关联性分析
• 4.1.4 薯蓣抗炭疽病种质筛选
• 4.1.5 农药筛选以及生防菌的筛选鉴定
• 4.2 结论
• 参考文献