拟南芥RRL基因的功能验证及分析

论文摘要

拟南芥根具有结构简单、组织均一等特点,是研究植物器官发育分子机理的良好材料。目前,对拟南芥根的形态建成及生长发育已有较为深入的研究。植物根的生长发育受控于相互作用的基因和激素之间的平衡,但是对胚后根顶端分生组织发育的分子机理并不是很清楚,尤其是线粒体在植物根生长发育中的调控作用还不清楚。以前的研究中,本室实验室发现了一个短根突变体rrg1（RETARDED ROOT GROWTH1）,克隆了RRGl基因（At1g69380）,并对其功能进行了分析。该基因编码一个未知功能的蛋白,亚细胞定位分析表明该蛋白定位于线粒体膜上,调控拟南芥胚后根顶端分生组织的细胞分裂进程。在拟南芥基因组中,RRG1（Atlg69380）存在一个同源基因At5g13610,命名为RRL （RETARDED ROOT GROWTH-LIKE）。本研究中我们对RRG1的同源基因RRL的功能进行了分析,获得主要结果如下：1.从拟南芥资源库购买了RRL （At5g13610）的T-DNA插入纯合突变体（SALK-022878C）,该突变体也表现出短根表型,将该突变体命名为rrl1。与野生型（Col-0）相比,突变体rrll根尖分生区面积大大缩减,分生组织细胞数目减少；但是胚根的形态建成和发育正常。2. RT-PCR和组织原位杂交结果表明,RRL基因在拟南芥各组织中除荚果外,都有表达。在根部主要在根尖分生组织表达。3.突变体rrll中SHR和SCR的表达模式没有发生变化,并且横向切片结果显示：根的径向结构发育正常,表皮、皮层、内皮层及中柱鞘细胞层数不变。表明RRL基因不参与拟南芥根分生组织干细胞活性及QC功能的调控。4.用不同浓度生长素处理突变体rrll,结果表明：RRL基因功能缺失并不影响突变体对生长素的响应；在突变体背景下,DR5、PIN1、PIN3和PIN4等标记基因表达不受影响,说明RRL基因突变不影响生长素的梯度运输以及分布,不参与生长素对根发育的调控途径。5.突变体rrll对外源细胞分裂素不敏感。通过RT-PCR分析细胞分裂素信号传导相关基因表达情况发现CKX4在突变体中的表达下降,说明RRL基因可能通过细胞分裂素信号途径调控根尖分生组织的生长发育。6. CYCB1是研究细胞分裂的特异性标记基因,在植物细胞分裂G2/M的转化中起到重要作用。在rrl1中,CYCB1;1的表达在突变体中表达下降,说明RRL基因突变影响了根尖分生组织细胞分裂的进程。7.通过生物软件预测及质谱分析发现RRL基因所编码的蛋白定位于线粒体中。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1 前言
• 1.1 拟南芥根发育模式
• 1.1.1 根的纵向结构
• 1.1.2 根的径向结构
• 1.1.3 拟南芥胚根的形态建成
• 1.2 拟南芥根发育的调控机制
• 1.2.1 位置信息对根发育的影响
• 1.2.2 静止中心在根发育中的作用
• 1.2.3 拟南芥根发育分子机制的研究进展
• 1.3 植物激素对拟南芥根发育的作用
• 1.3.1 生长素对拟南芥根发育的作用
• 1.3.1.1 生长素的种类和分布
• 1.3.1.2 生长素参与胚根的形态建成
• 1.3.1.3 生长素在根中的极性运输
• 1.3.2 细胞分裂素与植物根发育的研究进展
• 1.3.3 赤霉素、脱落酸和乙烯在根发育中的研究进展
• 1.4 植物基因功能的研究策略和研究方法
• 1.5 本研究的目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 拟南芥材料
• 2.1.2 实验所用到的菌株和载体
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 拟南芥种子消毒与种植
• 2.2.2 GUS染色与显微镜观察
• 2.2.3 拟南芥根激素处理
• 2.2.4 拟南芥根树脂切片
• 2.2.5 CTAB法提取拟南芥总DNA
• 2.2.6 拟南芥总RNA提取
• 2.2.7 RNA反转录
• 2.2.8 PCR和RT-PCR检测
• 2.2.8.1 PCR扩增
• 2.2.8.2 RT-PCR扩增
• 2.2.9 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
• 2.2.9.1 感受态细胞的制备
• 2.2.9.2 感受态细胞的转化
• 2.2.9.3 质粒DNA抽提
• 2.2.10 组织原位杂交
• 2.2.10.1 探针制备
• 2.2.10.2 原位杂交
• 2.2.11 组织特异性Marker line与突变体的杂交
• 2.2.12 荧光蛋白观察
• 3. 结果与分析
• 3.1 基因分析
• 3.1.1 拟南芥短根突变的来源
• 3.1.2 RRL基因蛋白结构预测
• 3.1.3 rrl1突变体的基因敲出验证
• 3.2 功能验证
• 3.2.1 突变体表型
• 3.2.2 基因的时空表达模式
• 3.2.3 RRL基因主要在胚后根的生长发育过程中起到作用
• 3.2.4 rrl1突变体中干细胞活性和静止中心功能的维持
• 3.2.5 rrl1突变体对生长素处理的应答
• 3.2.6 rrl1突变体对细胞分裂素处理不敏感
• 3.2.7 RRL基因影响细胞周期
• 4. 讨论
• 4.1 RRL基因调控拟南芥胚后根的生长发育
• 4.2 线粒体参与根的生长发育
• 4.3 激素与根生长发育
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 附录3
• 致谢