钩端螺旋体MLVA基因分型方法的建立及初步应用研究

论文摘要

钩端螺旋体病（简称钩体病）是一种人兽共患性疾病,世界范围内均有流行,尤其流行于热带地区,其病原体为钩端螺旋体（简称钩体）。自1955年本病被列入我国法定报告传染病以来,发生过几十次大规模钩体病流行。近年来,我国部分地区夏秋季节受洪涝灾害的影响,钩体病危害严重。钩体菌群菌型复杂、分布广泛,我国现已发现问号钩体有18个血清群75个血清型。传统的钩体分类方法仍然依赖于血清学分类,此方法操作繁琐,费时费力,交叉反应严重。随着现代分子生物学技术的飞速发展,一些分子分型方法相继出现,如多位点序列分型（multilocus sequence typing,MLST）、扩增片段长度多态性分析（amplified-fragment length polymorphism,AFLP）、限制性内切酶片段长度多态性分析（Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP）、脉冲场凝胶电泳（Pulsed-Field Gel Electrophoresis,PFGE）等,但均存在一些缺点,如分辨率低、重复性差、技术要求高等。近年来以可变数目串联重复序列（Variable number oftandem repeats,VNTR）为基础的分型方法,即多位点可变数目串联重复序列分析（Multilocus Variable-Number Tandem-Repeat Analysis,MLVA）,逐渐被广泛应用于分子流行病学研究中。为了解MLVA分型技术在钩端螺旋体基因分型中的效果,本研究初步选用VNTR4、VNTR7、V27、V29、V30、V36、V50七个VNTR位点,对我国的15群15型问号钩端螺旋体参考菌株、16群21型双曲钩端螺旋体参考菌株,以及四川、安徽、江西、湖南四省的地方分离菌株,共计271株钩体菌进行分析,观察不同MLVA基因型与地理分布的关系;发现不同地区的优势菌群;进一步结合现场流行病学调查,开展传染源、传播途径、基因组进化的研究。本研究成功扩增致病性的问号钩端螺旋体213株,验证了腐生性钩端螺旋体16群21型参考菌株扩增阴性的结果。213株问号钩端螺旋体分离株呈现8个基因群66种基因型,黄疸出血群为主要优势菌群,黑线姬鼠为主要宿主;MLVA基因型呈现明显的地理分布特征,不同地区的优势菌群不同,同一基因群,不同地区间存在明显差异;MLVA基因分型与PFGE基因分型、血清学分型有较好的相关性。本实验中所有标准菌株原始资料完整,来源广泛,涵盖了我国钩体常见的血清群和血清型,具有一定代表性,可以用于我国钩体监测、分子分型鉴定及溯源工作。综上所述,MLVA分类与血清学分类、PFGE基因分型方法相关性好,能够反映菌株间基因水平微小变异,比PFGE、血清学分类方法操作简单,实验周期短,成本低,不需要大量活菌,少量DNA即可满足实验要求,结果数字化,便于不同实验室间进行比对,但是MLVA分型方法尚处于初步应用阶段,因此,MLVA与PFGE两种方法相互补充可提高钩体基因分型的能力,为流行病学溯源、发现地方优势菌株、探讨钩体基因组进化提供了科学依据。

论文目录

• Abbreviation
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 综述
• 致谢