利用荧光定量RT-PCR和PCR方法检测结核分枝杆菌复合群

论文摘要

结核病仍然是全球重大公共卫生问题之一。早期诊断病原菌结核杆菌复合群对疾病传播的有效控制有重大影响。本研究的目的是建立一种新的能快速、准确检测结核病临床样本的荧光定量分析方法。我们建立了一种新的荧光定量试验方法（R/P试验）,这种方法结合了荧光定量RT-PCR和荧光定量PCR两种方法,运用杂交探针同时检测结核杆菌复合群（MTBC）的16SrRNA和16SDNA片段。总核酸（RNA和DNA）从临床样本中进行抽提。如果同时满足以下两个标准,我们就定义为阳性结果：标准1.如果荧光定量RT-PCR的CT值≤35,这说明临床样本中含有结核分枝杆菌复合群；标准2.如果荧光定量RT-PCR与荧光定量PCR两者拷贝数的比值≥1.51,这表明临床样本中持续存在活的结核分枝杆菌复合群。我们运用R/P方法检测了来自218例结核可疑患者的235份临床标本（其中207份是肺内标本,另外28份是肺外标本）,检测的结果同时与抗酸染色法、培养法、以及荧光定量PCR法进行比较。在解决了R/P试验与培养结果之间的分歧后,R/P试验方法总的灵敏度、特异度、阳性预测值、以及阴性预测值分别为98.2%、97.2%、91.7%、99.4%；而荧光定量PCR总的灵敏度、特异度、阳性预测值、以及阴性预测值则分别为83.9%、89.9%、72.3%、94.7%。此外,R/P方法监测了4例确诊结核患者的抗结核治疗效果,结果显示治疗前的拷贝数比值高于治疗后的。我们得出以下结论：R/P方法是一种快速、特异的直接检测方法,它可以区分出结核分枝杆菌复合群的死菌和活菌状态,因此可以更好的指导病人治疗,以及更准确的做出公共卫生决策。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略词
• 第一章 前言
• 第一节. 结核分枝杆菌复合群
• 1. 结核分枝杆菌生物学性状
• 2. 致病性
• 3. 免疫性
• 4. 结核病实验室诊断技术及控制策略
• 第二节. 荧光定量PCR（FQ-PCR）
• 1. 原理
• 2. 荧光标记方法的分类
• 3. 荧光定量PCR的定量方法
• 4. 实时荧光定量PCR技术的应用
• 第二章 材料和方法
• 第一节. 实验材料
• 1. 实验对象
• 2. 主要试剂
• 3. 主要仪器设备
• 第二节. 实验反应
• 1. 样本采集及前处理
• 2. 总核酸抽提
• 3. 引物和探针的设计与合成
• 4. 定量标准品的构建与制备
• 5. 逆转录反应体系
• 6. 荧光定量PCR反应
• 第三节. 结果判定及统计分析
• 第三章 结果
• 第一节. 实验条件的建立和优化
• 1. 结核分枝杆菌复合群DNA、RNA同时抽提方法及优化
• 2. 引物与探针的特异性分析
• 3. DNA标准品PCR鉴定及测序结果
• 4. 荧光定量PCR反应条件的优化
• 5. 绝对定量标准曲线
• 第二节. 临床样本验证
• 1. 临床灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分析
• 2. R/P检测和荧光定量PCR之间的比较分析
• 3. 治疗效果的监测
• 第四章 讨论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢