论文摘要
研究背景与目的肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤。20世纪中期以来,肺癌的发病率在多数国家呈明显上升趋势,且逐年不断增高,是世界各地最常见癌的一种,其发病率及死亡率占各种恶性肿瘤的首位。至今对于肺癌的早期发现、早期诊断尚缺乏有效的手段,因此研究和发现与肺癌发生、发展相关的因子对于肺癌的早期发现、早期诊断及治疗方案的拟定和预后的判断具有重要的意义。10号染色体丢失的磷酸酶基因及张力蛋白同源物（Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,简称PTEN）是近年来被克隆的一个新的抑癌基因,是1997年Li等在研究原发性乳腺癌第10q23染色体的同源性丢失时分离得到的1种新的抑癌基因。PTEN基因是一种具有磷酸脂酶活性的抑癌基因,作用于脂类底物3,4,5-三磷酸磷酯酰肌醇（phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate, PIP3）及蛋白底物局灶性黏附激酶（focal adhesion kinase, FAK）,使其去磷酸化,调节丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（Akt）的功能,抑制磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K）/Akt/蛋白激酶B（protein kinase B, PKB）信号通路转导,负性调节细胞生长,诱导凋亡并抑制细胞浸润、转移。目前已在多种肿瘤中发现存在PTEN基因的突变,如前列腺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、肺癌、膀胱癌、消化道肿瘤等。PIK3CA是一种体细胞突变的癌基因,是由Volinia等1994年利用原位杂交技术检测到的,定位于3q26.3。PIK3CA可以编码IA类磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3Ks）的p110α催化亚单位,活化的PI3Ks可以磷酸化4,5-二磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate, PIP2）而生成细胞内的重要第二信使3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3）。磷脂酰肌醇激酶-3家族（PI3Ks family）是一类调节信号通路的脂酶,与肿瘤的形成、细胞的增殖、粘附、存活和迁移等相关。卵巢癌、胃癌、结肠癌和头颈部鳞癌等都存在该基因的突变。以往对肺癌PTEN表达的研究为定性观察,探讨了PTEN在不同类型肺癌中的表达情况,但未见其在不同类型肺癌中表达的量化特点及基于量化改变的变化规律；此外,相关PIK3CA的研究还不够深入和系统,特别是在肺癌方面。因此,本研究拟进一步从量化水平探讨PTEN蛋白在正常肺组织,肺良性病变和肺癌组织中的表达,定量测试PTEN蛋白的表达强度,从量化的角度揭示肺癌组织中PTEN的表达特点及其规律,探讨肺癌组织中PTEN蛋白对肺癌的诊断价值；通过聚合酶链-单链构象多态性（PCR-SSCP）及DNA测序确定突变位点的肺癌组织标本,揭示PIK3CA基因突变与肺癌发展的关系；探讨PTEN蛋白表达及PIK3CA基因突变在肺癌进展中的作用及相互联系。材料和方法一、肺癌组织中PTEN蛋白表达的定量分析实验材料和分组：组织来自南方医科大学南方医院病理科2009-2010年间病理活检确诊标本,患者术前均未接受放疗或化疗。样本情况如下：肺癌组织72例,按照2004年WHO/IASLC肺癌组织病理学分级分类法,包括：鳞状细胞癌25例、腺癌42例、大细胞癌3例、小细胞癌2例；肺癌并有淋巴结转移26例,肺癌尚无淋巴结转移46例；中央型肺癌27例,周围型肺癌45例；pTNM分期Ⅰ期30例、Ⅱ期30例、Ⅲ期20例、Ⅳ期2例。取20例肺良性病变（肺结核8例,支气管扩张6例,肺大泡6例）和远离肿瘤的正常肺组织21例作为非肺癌对照组。实验方法：用免疫组织化学方法检测PTEN蛋白在不同类型肺组织中的表达,用Imageproplus图像分析技术测试PTEN蛋白的阳性单位（Positive Unit, PU）,分析不同类型肺组织中PTEN蛋白表达强度的变化规律及与肺癌临床病理特征之间的关系。统计学分析：用SPSS13.0统计分析软件进行处理。各组检测数据以平均值±标准差（x±s）表示。经方差齐性分析检验相应样本总体方差,方差齐者,多组间PU值的比较采用单向方差分析（One-Way ANOVA）,组间多重比较采用LSD或S-N-K法；方差不齐者,多组间PU值的比较采用近似F检验Welch法,组间多重比较采用Dunnett’s法。两组间PU值的比较采用独立样本t检验。配对样本间PU值的比较采用配对样本t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。二、肺癌诊断中PTEN蛋白表达的意义分析实验材料和分组：同材料方法一。实验方法：用免疫组织化学方法和Imageproplus图像分析技术定量检测72例肺癌组织、20例肺良性病和21例正常肺组织中PTEN蛋白的表达,结合诊断试验评价方法确定PTEN的诊断阈值,分析其在肺癌诊断和鉴别诊断中的辅助作用。统计学分析：用SPSS13.0统计分析软件进行处理。用诊断试验评价方法进行评价,用受试者工作特征曲线（receiver operation characteristic curve, ROC）分析PTEN蛋白的最佳阈值。P<0.05表示差异具有统计学意义。三、肺癌组织中PIK3CA基因的突变分析实验材料和分组：同材料方法一。实验方法：从石蜡包埋的正常肺组织,肺良性病变和肺癌组织中提取DNA,应用聚合酶链-单链构象多态性（PCR-SSCP）和基因测序技术检测PIK3CA基因的突变情况：首先合成PIK3CA外显子9和外显子20区域特异性引物（共两对引物）,PCR扩增待测DNA片段；用PCR-SSCP对PCR产物进行检测,确定突变的基因片段。对经PCR-SSCP检测出有异常电泳条带改变的DNA片段进行测序,确定突变类型,分析基因功能改变。统计学分析：用SPSS13.0统计分析软件进行处理。多组间突变率的比较用多个样本率的χ2检验,其中当有理论频数小于5时用似然比χ2检验（Likelihood Ratio）,当理论频数均大于5时用非校正φ2检验（Pearson Chi-Square）;两组间突变率的比较用两样本率的χ2检验,其中当有理论频数小于5时用校正χ2检验（Continuity Correction）,当理论频数均大于5时用非校正χ2检验（Pearson Chi-Square）。P<0.05表示差异具有统计学意义。四、肺癌组织中PTEN和PIK3CA相关性分析实验材料和分组：同材料方法一。增加的纳入标准是样本需PCR同时扩增出外显子9和外显子20,具体样本组成为：肺癌组织32例,按照2004年WHO/IASLC肺癌组织病理学分级分类法,包括：鳞状细胞癌12例、腺癌18例、大细胞癌1例、小细胞癌1例；肺癌并有淋巴结转移11例,肺癌尚无淋巴结转移21例；中央型肺癌11例,周围型肺癌21例；pTNM分期Ⅰ期18例、Ⅱ期7例、Ⅲ期7例、Ⅳ期0例。取14例肺良性病变组织（肺结核5例,支气管扩张3例,肺大泡6例）和远离肿瘤的正常肺组织12例作为非肺癌对照组。实验方法：分别用免疫组织化学方法和PCR-SSCP及基因测序技术检测不同类型肺组织中PTEN蛋白表达的阳性率和PIK3CA基因突变的情况,同材料方法一、三。统计学分析：各组PTEN蛋白表达PU值以平均值±标准差（x±s）表示。经方差齐性分析检验相应样本总体方差,方差齐者,多组间PU值的比较采用单向方差分析（One-Way ANOVA）,组间多重比较采用LSD或S-N-K法；方差不齐者,多组间PU值的比较采用近似F检验Welch法,组间多重比较采用Dunnett’s法。两组间PU值的比较采用独立样本t检验。多组间PIK3CA突变率的比较用多个样本率的χ2检验,其中当有理论频数小于5时用似然比χ2检验（Likelihood Ratio）,当理论频数均大于5时用非校正χ2检验（Pearson Chi-Square）;两组间突变率的比较用两样本率的χ2检验,其中当有理论频数小于5时用校正χ2检验（Continuity Correction）,当理论频数均大于5时用非校正χ2检验（Pearson Chi-Square）。组间相关性分析采用双变量相关分析,相关系数选择Spearman相关系数。P<0.05表示差异具有统计学意义。结果一、肺癌组织中PTEN蛋白表达的定量分析1、肺癌组织中PTEN的PU值低于正常肺组织和肺良性病变中PTEN的PU值（P=0.000）；肺良性病变PTEN表达的PU值低于正常肺组织（P=0.000）；肺鳞状细胞癌、肺腺癌、肺大细胞癌与肺小细胞癌中PTEN的PU值无统计学差异（P=0.906）；肺大泡、支气管扩张和肺结核中PTEN的表达差异无统计学意义（P=0.738）。2、肺癌组织及相应病例中组织结构正常的肺组织中的PTEN蛋白表达差异有统计学意义（P=0.000）。3、肺癌组织中PTEN的PU值与患者性别（P=0.708）、年龄（P=0.198）、吸烟史（P=0.924）、肺癌的大体类型（P=0.870）、肺癌的分化程度（P=0.227）、淋巴结转移情况（P=0.077）和pTNM分期（P=0.543）的关系均无统计学意义。二、肺癌组织中PTEN蛋白表达的诊断意义分析用免疫组织化学方法结合图像定量分析技术及阳性单位测试方法对肺癌组织中PTEN蛋白表达的强度进行定量分析,通过受试者工作特征曲线（receiver operation characteristic curve, ROC）分析PTEN蛋白用于肺癌诊断及鉴别诊断的阈值。当PTEN PU值>20.95时,诊断为非癌性病变；当1.00<PU值≤20.95时诊断结果不能排除癌的可能,可结合其他检测方法进一步确诊；倘若PTEN PU值≤1.00时,可以初步诊断为癌组织。三、肺癌组织中PIK3CA基因的突变分析1、对113例石蜡包埋的肺癌组织、肺良性病变和正常肺组织提取的DNA进行检测,共有84例提取成功,成功率为74.34%。2、应用PCR-SSCP技术检测84例组织中PIK3CA基因的突变情况,经重复SSCP银染分析发现,所检测的84例肺癌组织、肺良性病变和正常肺组织（其中包括同时扩增出外显子9和20有58例；只扩增出外显子9有11例；只扩增出外显子20有15例）中外显子9引物所扩增片断中有6例肺癌组织出现单链DNA电泳条带位置的改变,外显子20引物所扩增片断中有2例出现单链DNA电泳条带位置的改变,肺良性病变和正常肺组织中均未出现单链DNA电泳条带位置的改变。3、经PCR-SSCP检测出有电泳条带位置改变的8例肺癌组织中其PCR产物浓度均达到测序要求。测序结果经与PIK3CA基因DNA序列比对,发现其中有5例出现单个碱基的置换,包括：外显子9中有1例由碱基A变成C（编码的氨基酸由谷氨酸变成丙氨酸）,1例由碱基G变成C（编码的氨基酸由丝氨酸变成苏氨酸）,2例由碱基A变成G（编码的氨基酸由谷氨酸变成甘氨酸）；外显子20中有1例由碱基T变成A（编码的氨基酸由蛋氨酸变成丙氨酸）；另外3例未出现DNA序列的改变。4、经PCR-SSCP和基因测序技术检测不同类型肺组织中PIK3CA基因突变频率,结果发现69例成功扩增出PIK3CA外显子9的肺组织中4例出现单个碱基的突变,均是肺癌组织,包括：鳞状细胞癌1例,腺癌3例；73例成功扩增出PIK3CA外显子20的肺组织中有1例出现单个碱基的突变,也是肺癌组织,且为腺癌。正常肺组织和肺良性病变均未检测出单个碱基的突变,与肺癌组织相比较,差异具有统计学意义（P=0.042）。5、经PCR-SSCP和基因序列测序分析发现,肺癌组织中PIK3CA基因的突变与性别（P=0.236）、年龄（P=0.948）、吸烟史（P=0.330）、肺癌的分化程度（P=0.222）、肺癌的大体类型（P=0.428）、淋巴结转移情况（P=0.777）和pTNM分期（P=0.060）均无关。四、肺癌组织中PTEN和PIK3CA相关性分析1、正常肺组织、肺良性病变和肺癌组织相比较,三者中PTEN蛋白表达的强度差异有统计学意义（F=38.166,P=0.000）；肺癌与PTEN的表达强度呈显著负相关关系（r=-0.523,P=0.000）。2、正常肺组织、肺良性病变和肺癌组织相比较,三者中PIK3CA基因的突变率差异有统计学意义（χ2=6.329,,P=0.042）；肺癌与PIK3CA基因突变呈正相关关系（r=0.265,P=0.044）。3、肺组织中PTEN蛋白表达强度与PIK3CA基因突变率呈显著负相关关系（r=-0.281,P=0.031）。结论一、在正常肺组织、肺良性病变和肺癌组织中,PTEN蛋白的表达量依次减少；不同类型肺癌之间PTEN的表达基本相同；PTEN的表达与患者性别、年龄、吸烟史、肺癌的大体类型、肺癌的分化程度、淋巴结转移情况以及pTNM分期均无关,提示PTEN蛋白的低表达或缺失与肺癌有关。二、用PTEN PU值>20.95时,诊断为非癌性病变；当1.00<PU值≤20.95时诊断结果不能排除癌的可能,可结合其他检测方法进一步确诊；倘若PTEN PU值≤1.00时,可以初步诊断为癌组织。三、肺癌组织中存在有PIK3CA基因的突变,与正常肺组织和肺良性病变相比,突变的差异是有意义的,提示PIK3CA基因的突变可能与肺癌的形成有一定的关系。四、PTEN表达强度与PIK3CA基因的突变率呈负相关,说明PIK3CA基因的突变或PTEN异常表达与肺癌的发生有关。