茶树花青素还原酶基因的原核表达

论文摘要

儿茶素是茶树重要次生代谢产物茶多酚的主体组分，也是决定茶叶品质的主要化学成分，研究茶儿茶素合成途径中关键基因的功能，对茶树良种选育、茶叶品质调控具有重要意义。儿茶素合成途径基本探明，其中花青素还原酶（ANR）是儿茶素EC和EGC合成直接相关的酶类，本实验利用RT-PCR、原核表达、HPLC技术，对GeneBank登录的两条茶树ANR基因进行了克隆、目的蛋白的原核表达、蛋白酶活性检测、反应产物鉴定等；并对目的蛋白在原核表达中的诱导时间、诱导温度、诱导剂IPTG浓度、氨苄青霉素浓度进行了优化。主要研究结果如下：1.通过RT-PCR技术克隆了CsANR1和CsANR2的ORF序列，使用DNAMAN软件、SignalP3.0软件、SOPMA软件、SWISS-MODEL网站软件，对两个基因的序列进行了比对，预测了信号肽序列，模拟了蛋白质的二级和三级结构。结果显示：CsANR1和CsANR2两个基因的氨基酸序列一致性为79%；CsANR1其N段34个氨基酸为信号肽序列，CsANR2其N端44个氨基酸为信号肽序列，去除信号肽之后两个基因的氨基酸序列一致性为83%；CsANR1和CsANR2蛋白质二级结构元件数量和分布非常相似，模拟的三级结构也非常相似。蛋白质空间结构推测CsANR1和CsANR2具有相似的功能，但信号肽差异推测两种蛋白的亚细胞定位有差异。2.利用构建的pET-ANR1和pET-ANR2重组质粒，转化了表达宿主菌rosetta（DE3），并用IPTG诱导目的蛋白表达，通过对诱导时间、诱导温度、诱导IPTG浓度、氨苄青霉素浓度进行优化，确立以25℃为诱导温度，1.0mmol/L作为诱导IPTG浓度，200μg/mL作为诱导氨苄青霉素浓度，诱导5h为最佳诱导条件。3.使用亲和树脂对诱导产生的融合蛋白进行纯化，以CYA为底物，NADPH为辅酶，对CsANR1和CsANR2融合蛋白活性进行检测，通过HPLC分析酶促反应产物。结果显示，CsANR1和CsANR2融合蛋白均能催化CYA生成EC，证明它们都具有茶树ANR酶活性。4.通过实时荧光定量PCR技术研究了CsANR1和CsANR2基因在茶叶不同发育阶段的表达量，结果发现它们的表达趋势差异不大，表达量在芽和三叶中最高。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 1 文献综述
• 1.1 茶儿茶素生物合成途径及相关酶类研究现状
• 1.2 ANR基因研究进展
• 1.3 大肠杆菌表达系统
• 1.3.1 原核表达载体
• 1.3.2 真核基因在大肠杆菌中的表达
• 1.3.3 大肠杆菌表达系统的影响因素
• 2 引言
• 2.1 研究内容及意义
• 2.2 研究路线
• 2.3 研究内容
• 3 材料和方法
• 3.1 实验材料
• 3.2 仪器与试剂
• 3.2.1 主要药品和试剂
• 3.2.2 主要仪器
• 3.2.3 主要试剂的配方
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 CsANR1 和Cs ANR2 基因克隆
• 3.3.2 CsANR1 和Cs ANR2 基因重组载体的构建
• 3.3.3 CsANR1 与CsANR2 基因的原核表达
• 3.3.4 CsANR基因原核表达条件的优化
• 3.3.5 CsANR1 和CsANR2 融合蛋白的纯化
• 3.3.6 CsANR1 和CsANR2 融合蛋白酶活性的检测
• 3.3.7 CsANR1 和CsANR2 实时荧光定量PCR
• 4 结果与分析
• 4.1 RNA提取与质量检测
• 4.2 CSANR1 和CSANR2 基因的克隆和生物信息学研究
• 4.2.1 CsANR1 和CsANR2 全长基因的克隆
• 4.2.2 CsANR1 和CsANR2 的ORF序列分析
• 4.2.3 CsANR1 和CsANR2 的亚细胞定位分析
• 4.3 CSANR1 和CSANR2 的原核表达
• 4.3.1 不同时间诱导的融合蛋白的表达
• 4.3.2 最佳诱导温度
• 4.3.3 最佳诱导 IPTG浓度
• 4.3.4 最佳氨苄青霉素浓度
• 4.3.5 CsANR1 和CsANR2 融合蛋白的纯化
• 4.4 CSANR1 融合蛋白和CSANR2 融合蛋白酶活的检测
• 4.5 CSANR1 和CSANR2 实时荧光定量PCR分析
• 5 讨论
• 5.1 CSANR基因的生物信息学分析
• 5.2 CSANR1 和CSANR2 融合蛋白表达情况
• 5.3 CSANR1 和CSANR2 酶活性
• 6 结论
• 参考文献
• 附录 英文缩写及注释
• 致谢
• 作者简介