大鼠内嗅皮层微注射Orexin-A对睡眠—觉醒及空间记忆的影响

论文摘要

1998年发现的Orexin是一类小分子神经肽，也称hypocretin（hypocretin-1和hypocretin-2），由外侧下丘脑Orexin神经元产生，有两个单体：Orexin-A和Orexin-B。它们是来自同一基因转录产物。Orexin-A由33个氨基酸构成，其中有四个半胱氨酸形成链内的二硫键。Orexin系统主要通过Orexin-1（OX1R）受体和Orexin-2（OX2R）受体发挥作用，两受体均为G-蛋白偶联受体，OX1R和Orexin-A的亲和力高于Orexin-B，而OX2R与Orexin-A和Orexin-B亲和力相同。Orexin神经元的投射几乎遍布大脑的各个脑区，在维持觉醒中具有重要的意义，并且基因敲除小鼠或其受体基因突变可引起发作性睡眠病[1]。同时，研究发现Orexin神经元可以投射到海马（Hp），与空间学习记忆密切相关[2-4]。内嗅皮层（entorhinalcortex, EC）在海马和联合皮层的双向信息交流中起着接替站的作用。EC浅层主要神经元接受新皮层的输入，投射至海马。深层主要接受海马CA1和下托的输入，将其传回至新皮层。EC参与形成的海马-EC-新皮层环路在情景记忆的形成以及巩固中发挥重要的作用[5]。EC可分为外侧内嗅皮层（LEC）和内侧内嗅皮层（MEC）。目前认为MEC主要参与传递和处理空间信息，在空间认知功能中具有重要的意义[6-9]。本研究采用多导睡眠记录和微注射技术，首先观察内嗅皮层内，外源性的OrexinA对大鼠睡眠-觉醒周期时间的影响，然后采用T-迷宫交替选择模式初步观察内嗅皮层OrexinA对大鼠空间记忆的影响，之后采用旷场实验观察微注射OrexinA对大鼠运动功能及探索行为的影响。结果如下：1． Orexin受体在EC中的表达及在浅层中与reelin和calbindin的共表达对成年大鼠EC脑片进行OX1R和OX2R免疫荧光化学检测，观察orexin受体在EC中正常表达和在浅层中与reelin和calbindin的共表达情况。结果显示：浅层中OX1R的表达较深层要高得多，OX2R在EC中的表达模式与OX1R类似；OX1R在reelin阳性细胞和calbindin阳性细胞中均有表达，表明OX1R可能广泛表达于EC浅层的主要神经元中。同时考虑到EC的reelin和calbindin信号在空间学习记忆中的重要作用，这也暗示了Orexin受体在空间学习记忆中的重要作用。2．Orexin A对睡眠-觉醒周期的影响在内嗅皮层脑区微注射不同剂量Orexin A，观察大鼠睡眠-觉醒的变化。与ACSF自身对照相比，分别给大鼠内侧内嗅皮层双侧微注射不同浓度的0.04nmol,0.06nmol,0.1nmol orexinA后3小时11：00～12：00、12：00～13：00、13：00～14：00觉醒周期时间无影响（P>0.05），给药后24h觉醒周期时间也无显著差异（P>0.05）。及在11：00～14：003小时内对觉醒时间无影响（P>0.05），在11：00～14：003h内NREM时间无影响（P>0.05），在11：00～14：003小时后REM也无影响（P>0.05），即对3h内（11：00～14：00）大鼠总睡-眠觉醒时间无显著性差异（P>0.05）。结果显示大鼠内嗅皮层微注射OrexinA对它的睡眠-觉醒周期无影响。3．Orexin A受体阻断剂SB-334867对睡眠-觉醒周期的影响在内嗅皮层脑区微注射Orexin A受体阻断剂SB-334867，观察睡眠-觉醒周期变化。与DMSO自身对照相比，给大鼠内侧内嗅皮层双侧微注射SB-334867（0.1nmol，5μl）后3小时11：00～12：00、12：00～13：00、13：00～14：00觉醒周期时间无影响（P>0.05），给药后24h觉醒周期时间也无显著差异（P>0.05）。及在11：00～14：003小时内对觉醒时间无影响（P>0.05），在11：00～14：003h内NREM时间无影响（P>0.05），在11：00～14：003小时后REM也无影响（P>0.05），即对3h内（11：00～14：00）大鼠总睡-眠觉醒时间无显著性差异（P>0.05）。表明大鼠内嗅皮层微注射SB-334867对睡眠-觉醒周期无影响。4．EC脑区Orexin A对空间记忆的影响1)Orexin A受体阻断剂SB-334867对空间记忆的影响在内嗅皮层脑区微注射，分别按两种T-迷宫模式（保持模式，获得模式），观察对空间记忆的影响。连续训练大鼠，在内侧内嗅皮层区微注射，对大鼠DMSO组间对照和OrexinA受体阻断剂SB-334867给药后的T-迷宫选择正确次数进行统计。给大鼠内嗅皮层双侧微注射SB-334867（6mM，0.5μl），T-迷宫交替选择正确次数明显减少，正确率下降78%，有显著性差异（p<0.05）。提示SB-334867影响了空间记忆，降低了空间记忆功能。即内嗅皮层内源性OrexinA促进了空间记忆功能。2)敲低Orexin A受体表达（RAAV2/1-OR1-shRNA-EGFP）对大鼠空间记忆的影响大鼠内嗅皮层微注射手术，在内嗅皮层脑区微注射空白对照组SCR（RAAV2/1-SCR-shRNA-EGFP）及干扰组OR1（RAAV2/1-OR1-shRNA-EGFP），观察内嗅皮层敲低Orexin A受体表达后对大鼠空间记忆的影响。以SCR对照在内嗅皮层微注射OR1干扰病毒，分两组，对大鼠SCR组间对照组和OR1干扰组分别21天后开始T-迷宫训练，训练持续21天。对其结果进行统计，交替选择正确次数减少，正确率下降48%，有显著性差异（p<0.05）。提示，敲低Orexin A受体表达，降低了空间记忆功能。即内嗅皮层Orexin A受体参与了且提高了空间记忆能力。5.术后内嗅皮层微注射药物对大鼠探索行为及运动功能的影响大鼠内嗅皮层套管埋置手术恢复后，在内嗅皮层脑区微注射对照ACSF,DMSO以及药物组Orexin A及其受体阻断剂SB-334867，观察对探索行为和运动功能的影响。在内嗅皮层分别微注射药物（ACSF,DMSO,orexin A,SB-334867）分四组，对大鼠ACSF,DMSO组间对照和Orexin A及受体阻断剂SB-334867给药15min后在旷场中的站立次数和所走的格子数进行统计。给大鼠内嗅皮层微注射（0.1nmol，0.5μl）Orexin A，大鼠的站立次数和行走的格子数无明显变化，无显著性差异（P>0.05）；微注射（6mM，0.5μl）Orexin A受体阻断剂SB-334867，大鼠站立次数和行走的格子数无明显变化，无显著差异（P>0.05）。表明术后内嗅皮层微注射药物对大鼠探索行为及运动功能无影响。综上所述，本研究结果表明:一，EC区OR1在reelin阳性和calbindin阳性神经元中都有表达。二，EC微注射不同剂量Orexin A对大鼠的睡眠-觉醒周期无影响。三，EC微注射Orexin A受体阻断剂SB-334867对大鼠睡眠-觉醒周期无影响。四，EC脑区的orexinA信号对大鼠空间记忆功能有重要影响。五，术后微注射药物对大鼠的探索行为和运动功能无影响。

论文目录

• 英文缩写一览表
• 英文摘要
• 中文摘要
• 前言
• 第一部分 大鼠内嗅皮层微注射 Orexin-A 对睡眠-觉醒的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 大鼠内嗅皮层微注射 Orexin-A 对空间-记忆的影响
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 致谢
• 文献综述 Orexin 及其受体的主要生理功能及相关机制
• 参考文献
• 在读硕士期间发表的论文