一株禽H1N1流感病毒血凝素蛋白的纯化、鉴定和结构分析

论文摘要

甲型流感是含有八个负链RNA片段的RNA病毒,共编码11种蛋白质。其中的血凝素蛋白（HA）,是流感病毒主要的表面蛋白之一,负责与宿主细胞受体结合而启动病毒感染。目前研究表明,HA具有受体结合偏好性,禽流感病毒HA偏好Siaα2,3Gal糖受体,人流感病毒HA偏好Siaα2,6Gal糖受体。所以,禽流感病毒不能在人类中有效复制,人流感病毒也不能通过天然途径在水禽中有效复制。如果禽流感病毒要感染人,必须和人流感病毒共同感染被称为“基因混合器”的中间宿主猪,重组获得新的受体结合偏好性。然而,引发1997年香港禽流感病毒感染人事件的禽H5N1流感病毒株仍然具有Siaα2,3Gal糖受体偏好性,这说明HA的受体结合偏好性理论可能不适应于一些禽流感病毒亚型。因为H1N1流感病毒感染人类历史记录最长,而且和H3N2共同流行于人类、猪和禽类中,是研究流感病毒宿主适应性和跨种传播的理想模型。所以本论文以一株禽H1N1流感病毒A/WDK/JX/12416/2005为主要研究对象,首先综合应用鸡胚培养病毒、超速离心、蔗糖密度梯度离心、酶切、碱性阴离子交换、透析、SDS-PAGE电泳等技术,获得了高纯度HA蛋白。这是一套直接从病毒颗粒上获得流感病毒血凝素蛋白的方法,这种方法确保所获得的血凝素蛋白分子结构同病毒颗粒上的血凝素蛋白高度一致。在用质谱进一步鉴定纯化的HA蛋白时,通过和HA基因序列比较发现,HA蛋白序列有七个氨基酸置换位点,分别是E103K,R130K,T169I,I338V,N387S,S398I/L和I399S。因为流感病毒使用不同的聚合酶机制进行复制和转录,这些置换可能是在基因复制过程引入,也可能是在病毒mRNA转录过程引入。这个结果,第一次提供了流感病毒HA蛋白氨基酸序列和HA基因序列不一致的实验证据。本文通过X射线衍射解出第一株禽H1N1流感病毒HA以及其与人、禽流感病毒受体类似物复合物的晶体结构。结果发现,除了糖基化方式外,禽流感病毒HA和哺乳动物流感病毒HA的结构大体相似,而且并没有表现出偏好Siaα2,3Gal糖受体的特性,而是和两种受体类似物具有相同的结合效率。也就是说,在禽H1N1流感病毒中,HA和两种受体类似物的结合效率是一样的,糖苷键连接类型可能不是决定宿主受体偏好性的关键。

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ABSTRACT

缩略词简表

第一章前言

1.1 背景

1.1.1 禽流感概述

1.1.2 HA 概述

1.1.3 HA 与流感病毒致病力的相关性

1.1.4 HA 与流感病毒宿主范围限制性的相关性

1.2 本论文的研究目标、内容与意义

第二章 HA 蛋白的纯化

2.1 实验材料

2.1.1 仪器设备及耗材

2.1.2 实验试剂

2.1.3 其它材料

2.1.4 应用软件

2.2 实验方法

2.2.1 血凝活性实验

2.2.2 血凝抑制（HI）活性实验

2.2.3 神经氨酸酶抑制活性实验

2.2.4 RT-PCT 和测序

2.2.5 系统分析

2.2.6 Bradford 蛋白测量法

2.2.7 SDS-PAGE 法

2.2.8 病毒培养

2.2.9 病毒纯化

2.2.10 HA 纯化

2.3 结果与分析

2.3.1 亚型鉴定结果

2.3.2 病毒纯化结果

2.3.3 HA 纯化结果

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 HA 蛋白的质谱鉴定及变异分析

3.1 实验材料

3.1.1 仪器设备及耗材

3.1.2 实验试剂

3.1.3 应用软件及网站

3.2 实验方法

3.2.1 胶内消化

3.2.2 多肽的纯化

3.2.3 纳升电喷雾质谱分析

3.3 结果与分析

3.3.1 质谱分析结果

3.3.2 质谱结果与基因测序结果的比较

3.4 讨论

3.5 小结

第四章结构分析HA 的受体结合特性

4.1 实验材料

4.1.1 仪器设备及耗材

4.1.2 实验试剂

4.2 实验方法

4.2.1 蛋白结晶

4.2.2 结构分析

4.3 结果与分析

4.3.1 avHA05 的一级结构

4.3.2 avHA05 的晶体结构

4.3.3 avHA05 的糖基化

4.3.4 avHA05 和禽流感病毒受体类似物的作用

4.3.5 avHA05 和人流感病毒受体类似物的作用

4.3.6 比较 avHA05 和哺乳动物流感病毒 HA 与受体类似物的作用

4.3.7 比较 avHA05 和其它亚型禽流感病毒 HA 与受体类似物的作用

4.4 讨论

4.5 小结

结论

参考文献

致谢

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