猪链球菌2型保护性抗原的筛选研究

论文摘要

猪链球菌2型（Streptococcus suis serotype 2; SS2）感染已经成为一种严重的人畜共患病,不仅造成大量猪死亡,更严重威胁着人类健康。我国于1998年和2005年两次在江苏和四川暴发人感染猪链球菌2型疫情,分别造成14人和39人死亡。不同于国外人感染病例以脑膜炎为主的特点,我国死亡病例多为休克型,病例起病急,病情重,病程短,死亡率高。目前对我国SS2的致病机制知之甚少,目前已知的毒力因子还不能全面解释毒素休克综合征（TSS）的发生,而对致病机制的缺乏了解又阻碍了SS2疫苗的研究。已知的毒力因子和保护性抗原包括荚膜多糖（CPS）、溶菌酶释放蛋白（MRP）、胞外因子（EF）、溶血素（SLY）、烯醇酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6PGD）、Sao等。在此基础上发现更多、更有效的保护性抗原成为SS2疫苗研究工作的当务之急。本研究通过免疫蛋白质组学识别出SS2菌株98012细胞壁和上清蛋白中的32种免疫原性蛋白,其中8种为细胞壁蛋白、5种为非细胞质蛋白（Non-Cytoplasm Protein）、其它为胞质蛋白。使用比较蛋白质组学方法识别出我国高致病株与普通致病株差异表达蛋白,并进行后续验证。选择其中的10种蛋白以pET-32a（+）为载体重组表达,表达已知保护性抗原MRP为后续研究阳性对照。免疫大鼠获得抗血清,Western Blot验证10种蛋白在16种不同SS2菌株中的存在状况,发现SSU980171、SSU981094、SSU981549、SSU981819、SSU1664五种抗原在不同菌株间高度保守,SSU980156、SSU980197、SSU980201、SSU980267、SSU981675在不同菌株之间表达有差异。分析比较蛋白质组学结果以及后面的验证结果,并与不同菌株的致病力相结合,笔者将SSU980156、SSU980197、SSU980267、SSU981675这4种蛋白定义为不同致病力菌株之间的差异表达蛋白,其中SSU981675为国内高致病株与国外致病株之间的差异蛋白,SSU980197、SSU980267在不同菌株间存在多态性。随后对除SSU980156之外的其它10种重组抗原进行评价。比较6名病人和5名健康人血清中针对10种重组抗原的抗体差异,结果显示SSU980197、SSU981094、SSU981549、SSU1664、MRP的抗体水平在病人比健康人显著性升高。比较针对10种重组抗原的抗体在人工感染小型猪前后血清中的变化情况,结果显示SSU980197、SSU981094、SSU981549、SSU981675、SSU1664的抗体在感染后比感染前显著性升高。比较针对10种重组抗原的抗体在灭活全菌免疫小型猪前后的变化情况,结果显示SSU980197、SSU980267、SSU981094、SSU981549、SSU1664、MRP的抗体在免疫后比免疫前显著性升高。体外大鼠抗血清调理吞噬试验显示有6种蛋白的抗血清调理杀菌率在50%以上,分别是SSU980171、SSU980197、SSU980267、SSU981094、SSU981819、SSU1664。根据前期试验结果,选择7种抗原以pET-28a（+）为载体重新表达,以去除TRX（硫氧还蛋白）对动物试验的影响,成功表达出5种抗原。使用QS-21（皂角甙的精细提取物）为佐剂,在CD-1小鼠模型上验证5种抗原的保护效果。首先对5种抗原单独免疫保护效果进行评价,使用1.5×LD50的98012菌液攻毒, SSU980197、SSU981094、SSU981675、MRP免疫组有较高存活率,分别为70%、67%、60%、70%,与单纯QS-21免疫组比较,经Wilcoxon检验分析,均有显著性差异,而SSU1664免疫组没有保护性。增加攻毒量后SSU980197、SSU981094、SSU981675、MRP免疫组存活率均下降,分别为20%、20%、50%、20%。与单纯QS-21免疫组比较,均有显著性差异,而SSU1664免疫组仍然没有保护效果。对保护效果好的SSU980197、SSU981094、SSU981675尝试使用组合抗原免疫小鼠。使用6.6×LD50的98012菌液攻毒,分组为SSU980197、SSU981094、SSU981675、SSU980197与SSU981675组合、SSU981094与SSU981675组合、SSU980197与SSU981094组合、三种蛋白组合免疫,7个试验组,存活率分别是30%、30%、30%、50%、40%、30%、60%,与单纯QS-21免疫组比较,经Wilcoxon检验分析,均有显著性差异。7个免疫组之间比较,仅三种蛋白组合免疫组与SSU980197单独免疫组有显著性差异。进一步比较SSU980197、SSU981094和SSU981675三种蛋白组合免疫组以及SSU980197和SSU981675两种蛋白组合免疫组的保护效果。4.8×LD50的98012菌液攻毒时,三种蛋白组合免疫组,SSU980197与SSU981675组合免疫组的存活率分别是60%和40%,两组间无显著性差异。使用7×LD50的98012菌液攻毒,三种蛋白组合免疫组和SSU980197+SSU981675组合免疫组的存活率分别是50%和20%,经Wilcoxon检验分析,两组间有显著性差异,提示三种蛋白组合免疫组对高剂量菌液的攻毒仍然有保护效果。将筛选出的3种保护性抗原SSU980197、SSU981094、SSU981675命名为SIP1、Lpp36、SIP2。构建基因缺失突变株05ZYΔLpp36和05ZYΔSIP2。为后续的功能研究奠定基础。

论文目录

• 缩略词表
• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 猪链球菌2 型免疫蛋白质组学和比较蛋白质组学研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 98012 菌株细胞壁样品和上清样品中免疫原性蛋白
• 2.2 质谱鉴定和结果查询
• 2.3 比较蛋白质组学研究
• 2.4 重组抗原的选择
• 2.5 抗血清的获得
• 2.6 Western-blot 验证所筛选抗原在不同猪链球菌2 型菌株中的存在状况
• 2.7 PCR 及测序结果
• 2.8 所筛选抗原的保守性及差异表达分析
• 3 小结
• 第二部分 重组抗原的保护效果评价
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 人和小型猪血清学分析
• 2.2 体外抗血清调理吞噬试验
• 2.3 重组表达质粒的构建
• 2.4 重组抗原的诱导表达和纯化
• 50 的测定'>2.5 LD₅₀的测定
• 2.6 免疫小鼠存活试验
• 3 小结
• 第三部分 猪链球菌2 型基因敲除突变体的构建
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 敲除载体的构建
• 2.2 阳性克隆的获得
• 2.3 突变株的鉴定
• 3 小结
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 在读期间发表论文情况
• 个人简历
• 致谢