论文摘要
石斛属（Dendrobium Sw.）隶属兰科（Orchidaceae）树兰亚科（Epidendroideae）,是兰科第二大属,全球约有1,000多种,主要分布于亚洲热带、亚热带及大洋洲。我国石斛属植物主要分布于秦岭以南山脉,尤其在云南南部分布较多。石斛属植物的传统分类,主要依据形态学特征；而基于分子数据的系统分类研究中,常用ITS序列进行分析,但仅依靠形态学或单一基因片段研究石斛属植物的亲缘关系具有局限性。因此,需要将更多的分子证据与形态学特征等因素结合起来分析,进行石斛属植物的系统重建研究。从目前分子系统学研究趋势来看,低拷贝核基因正成为一种新型研究工具。已有研究表明,LFY同源基因是一种低拷贝核基因,在较低阶元的系统发生学研究中应用较多。本论文首先基于兰科已有的LFY同源基因保守区设计引物,对细茎石斛（Dendrobium moniliforme （L.） Sw.）该基因进行克隆及序列分析。通过普通PCR及Tail-PCR技术得到细茎石斛LFY同源基因--DenLFY,全长共3,575 bp,包含3个外显子和2个内含子。BLAST比对结果表明,该基因与兰科其它植物同源基因序列相似度很高,均达80%以上。氨基酸序列对比分析结果表明,该基因C端编码的氨基酸相对更为保守。从DenLFY基因外显子和内含子单独分析来看,外显子的获得及其编码氨基酸的推测对于LFY基因功能的研究是一个开端,内含子2在细茎石斛和铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）中存在长度差异,对于石斛药材的鉴定可能存在应用价值。论文基于核LFY同源基因内含子1、ITS、trnL-trnF序列研究36种石斛属植物种间的亲缘关系,结果表明石斛属植物LFY同源基因内含子1序列长度适中,可变位点及简约信息位点数多,适于进行系统发生学研究。利用LFY同源基因的内含子1所构建的系统树,与先前石斛属系统重建相比,分支支持率明显提高,且大部分亲缘关系较近物种也得以区分。我们通过核低拷贝基因的扩增及应用分析,清楚的揭示了单拷贝LFY基因第一个内含子的可用性,探寻到了一种除ITS以外,可用于石斛属种间系统发生分析的DNA分子标记。从联合构树与单基因片段构树比较来看,多片段联合分析增加了可变信息位点数,对重建石斛属植物的系统关系研究优于单个基因片段,且分支支持率普遍提高,各个物种间亲缘关系都得到很好的解决。本论文中的36个石斛物种分别隶属于石斛属形态学分类的九个组。联合片段重建石斛属系统发生树结果表明,蝴蝶石斛与竹枝石斛聚为一枝,位于系统树分支的基部。石斛组是石斛属中最大的组,该组物种聚为两大枝,部分种间关系与形态学证据一致,其中铁皮石斛与曲茎石斛、滇桂石斛与黄石斛、细茎石斛与霍山石斛、矩唇石斛与金钗石斛等分别聚为姐妹枝。顶叶组的五个物种没有聚为一枝,形态性状例如花序、唇瓣极为相似的密花石斛与球花石斛,聚石斛与小黄花石斛分别聚在一起,鼓槌石斛与其关系较远。属于瘦轴组的重唇石斛和钩状石斛没有聚在一起,但二者均与石斛组植物聚在一起,从形态特征上分析,重唇石斛、钩状石斛的叶、茎均与石斛组植物极为相似,只有花中唇瓣略有不同。石斛属植物亲缘关系比较复杂,能否找到合适的分子标记,并结合形态学特征,是解决中国石斛属植物系统发生关系的关键。本论文的研究结果证实,LFY同源基因第一个内含子适于石斛属系统发生学研究,联合多基因片段构树对于重建石斛属种间亲缘关系具有重要意义。