论文摘要
缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemic encephalopathy, HIE）是指围产期窒息导致脑的缺氧缺血性损伤,而出现的一系列中枢神经系统异常的表现,是新生儿时期脑损伤的常见原因,也是导致儿童发生严重神经系统后遗症的主要原因。2005年WHO资料显示,全球每年有400万新生儿死亡,与窒息相关者占23%,欧美等发达国家,中重度新生儿HIE的死亡和严重伤残率高达53%～61%,而发展中国家的状况远甚于此。目前临床上对于HIE的发病机制的研究虽然取得了很大进展,但仍缺乏特效治疗方法。长期以来,人们认为中枢神经系统损伤后不能修复,但近年来在对神经干细胞（neural stem cells, NSCs）的研究中,人们发现在大脑的某些部位如侧脑室管膜下（subventricular zone, SVZ）和海马齿状回（hippocampus dentate gyrus, DG）终身存在着内源性的NSCs,脑损伤可刺激这些NSCs增殖、分化,进行自我修复。已经有文献报道,新生大鼠在缺氧缺血性脑损伤（hypoxic-ischemic brain damage, HIBD）后,脑内源性NSCs有增殖和分化现象。但内源性NSCs不仅数量有限,而且受到神经营养因子缺乏、轴突生长抑制因子存在等因素影响,大脑的这种自生修复潜能有限,因此,能够找到一种将大脑自生修复功能放大的方法将为HIE的治疗带来广阔的前景。高压氧（hyperbaric oxygen HBO）应用于新生儿HIE的治疗已经有数十年的历史。我国从上世纪90年代开始应用HBO治疗HIE以来,大部分文献报道认为HBO可减轻患儿症状,降低病死率和伤残率。我们最近的研究也已证实,HBO不仅可促进HIBD新生大鼠内源性NSCs的增殖,并且还可促进增殖的内源性NSCs向损伤的大脑皮层迁移并分化为成熟的神经元。近来,国外有学者回顾分析近15年来NCBI（National Center for Biotechnology Information）关于HBO治疗脑缺血的文章,有六十多个关于HBO治疗动物及人脑缺血性损伤的研究,结果显示,HBO可以改善局灶性脑缺血、全脑缺血、新生儿HIE、蛛网膜下腔出血的预后,HBO可以用于治疗人中枢神经系统缺血性损伤HBO可以减轻HIBD大鼠的神经损伤并促进其恢复,HBO治疗HIBD新生大鼠时,可促进脑内NSCs的增殖,其机制可能与Wnt信号的活化有关。过去几年中,一系列在体与离体的研究已经显示Wnt信号分子对组织干细胞包括NSCs的增殖分化及命运决定起着重要调控作用。β-catenin是Wnt信号通路中关键分子,缺血性脑损伤时,β-catenin在调节神经干细胞的增殖、分化、移位过程中起着关键作用。β-catenin在神经前体细胞（neural precursor cells, NPCs）的高表达会引起大脑皮质神经前体细胞的增殖,相反,如果NPCsβ-catenin缺失,将会导致神经元损伤,细胞增殖减少,并引起细胞凋亡。研究显示,β-catenin激活后转入胞核内,与TCF结合为复合体（β-catenin/TCF）后,激活神经元素（neurogenins, Ngns）和细胞周期蛋白（CyclinD1）, Ngn1作为转录激活剂,使下游的分化基因NeuroD, Math2等增多,诱导晚期NPCs分化为神经元。NPCs在分化成神经元的过程中,骨形成蛋白（bone morphogenetic protein, BMP）的表达日益增多,BMP则反馈抑制NPCs向神经元分化,而促进其向星型胶质细胞分化。那么,HBO治疗新生儿HIBD时Wnt/β-catenin信号系统是如何调控NSCs增殖分化的?目前仍不是十分清楚。鉴于Wnt信号通路在NSCs的增殖、迁移和分化中的重要地位,我们对HBO能够促进HIBD新生大鼠NSCs增殖这一现象提出如下工作假设：HBO→Wnt→β-catenin进入细胞核→形成β-catenin /TCF→转录Ngn1基因→诱导NPCs向神经元分化（?）BMP→诱导NPCs向星形胶质细胞分化故本课题旨在离体细胞水平,进一步探讨HBO促HIBD新生大鼠NSCs增殖分化的机制,以期为HBO治疗HIBD的临床应用提供有力的理论依据。为此,我们参照文献分别将NSCs在正常脑组织匀浆及HIBD脑组织匀浆中培养,以模拟正常及HIBD时脑内微环境,再给予HBO处理,通过将β-catenin siRNA转染到NSCs内来验证这一假说：离体细胞水平,β-catenin调控了HBO引起的HIBD新生大鼠NSCs的增殖分化。本研究分三部分：一、构建靶向大鼠β-catenin基因的shRNA的真核表达质粒,并筛选出沉默β-catenin基因效果最明显的shRNA表达质粒目的构建靶向大鼠β-catenin基因的shRNA的真核表达质粒,并筛选出沉默β-catenin基因效果最明显的shRNA表达质粒。方法设计3对针对β-catenin基因不同位点的shRNA片段,构建携带此shRNA片段的真核表达质粒（shRNA1-3）并行测序分析。然后通过电穿孔法将重组质粒转染到神经干细胞中,48 h后测定转染率,并分别采用RT-PCR及Western blot检测β-catenin mRNA和β-catenin蛋白表达情况。结果靶向大鼠β-catenin基因的shRNA真核表达重组质粒pGCPU6/GFP/Neo shRNA-1,2,3经测序证实构建成功。质粒在神经干细胞中的转染率约为62.63%±15.9%。shRNA1,shRNA2,shRNA3转染入神经干细胞48 h后,β-catenin RNA水平和蛋白水平均明显低于阴性对照组和空白对照组（0.17±0.01、0.09±0.01、0.08±0.00vs 0.75±0.01,0.74±0.02；0.21±0.16.0.19±0.12.0.12±0.10, vs 0.56±0.02,0.65±0.01,均P<0.01）。与shRNA1和shRNA2相比,shRNA3对β-catenin mRNA和蛋白的抑制作用均最强（89.37% vs 77.08%,88.02%；77.95% vs 61.31%、65.65%）.结论成功构建并筛选出的靶向大鼠β-catenin基因的shRNA真核表达质粒对神经干细胞的β-catenin表达具有明显抑制作用。为研究Wnt/β-catenin信号途径在NSCs生长分化中的作用奠定基础。二、HBO对NSCs增殖分化的影响目的探讨HBO和脑组织匀浆上清液对离体SD大鼠NSCs分化的影响。方法传至2-3代的SD大鼠NSCs,随机分为九个组,未转染质粒者设为空白对照组（CON）,其余8组根据转染阴性对照质粒和转染β-catenin shRNA真核表达质粒及给予后续处理的不同分组,九组细胞在同一时间行免疫荧光染色,分别进行NSE、GFAP、04染色,荧光显微镜下计数各组NSCs分化为NSE阳性细胞、GFAP阳性细胞和O4阳性细胞的百分率,并进行比较。结果与CON组相比,转染阴性对照质粒的NSCs（ncNSCs）中：HBO组,N组,HIBD组分化为神经元和少突胶质细胞的百分比明显增加（P<0.05）,其中HIBD组增加最多,在此基础上再给予HBO处理,ncNSCs向神经元的分化会进一步增加,少突胶质细胞的分化也相应增加；N组,HIBD组,HIBD+HBO组分化为星形胶质细胞的百分比明显减少了（P<0.05）。与CON组相比,转染β-catenin shRNA的4组NSCs（siNSCs）,分化为神经元的百分比都明显减少了（P<0.01）,分化为星形胶质细胞的百分比都明显增加了（P<0.01）；少突胶质细胞的分化增加,但少于ncNSCs（P<0.01）,其中HIBD组分化为神经元和少突胶质细胞较多,在此基础上再给予HBO处理,神经元和少突胶质细胞的分化进一步增加。结论（1）HBO可促进HIBD大鼠ncNSCs分化为神经元和少突胶质细胞而抑制其向星形胶质细胞分化。（2）β-catenin shRNA抑制了siNSCs向神经元分化而促进了其向星形胶质细胞的分化,这一作用虽可被HBO弱化但不能被HBO逆转。（3）β-catenin参与了HBO引起的HIBD大鼠ncNSCs向神经元分化。三、HBO对NSCs Ngn1, BMP4表达的影响目的探讨HBO和脑组织匀浆上清液对离体SD大鼠神经干细胞Ngn1, BMP4表达的影响。方法传至2-3代的SD大鼠NSCs,随机分为九个组,未转染质粒者设为空白对照组（CON）,其余8组根据转染阴性对照质粒和转染β-catenin shRNA真核表达质粒及给予后续处理的不同分组,在同一时间收集上述9组细胞,分别提取细胞总RNA和总蛋白,行RT-PCR和Western blot,以测定Ngn1, BMP4 mRNA和Ngn1, BMP4蛋白的表达情况,并进行比较。结果与CON组相比,4组ncNSCs的Ngn1 mRNA和Ngn1蛋白的表达明显增加（P<0.01）而BMP4 mRNA和BMP4蛋白的表达明显减少（P<0.01）；在siNSCs,与CON组和ncNSCs组相比,4个siNSCs组的Ngn1 mRNA和Ngn1蛋白的表达明显减少（P<0.01）, BMP4 mRNA和BMP4蛋白的表达明显增加（P<0.01）,4个siNSCs组间Ngn1和BMP4的表达无统计学差异。结论（1）HBO可促进ncNSCs Ngnl的表达,抑制BMP4的表达,（2）β-catenin基因被抑制后,siNSCs的Ngn1蛋白和mRNA的表达被抑制,BMP4蛋白和mRNA的表达被促进,（3） BMP4和Ngn1在大鼠NSCs的增殖分化中起着重要的协调作用,Ngn1可能是一种潜在的神经元促成剂。综上所述,本研究结论如下：1、成功构建并筛选出的靶向大鼠β-catenin基因的shRNA真核表达质粒对大鼠神经干细胞的β-catenin表达具有明显抑制作用。2、HBO可促进离体HIBD大鼠NSCs分化为神经元和少突胶质细胞而抑制其向星形胶质细胞分化。3、HBO促进离体大鼠神经干细胞分化为神经元与β-catenin的激活有关4、离体细胞水平,HBO是通过激活β-catenin上调Ngn 1的表达促进NSCs分化为神经元,通过下调BMP4的表达减少NSCs分化为星形胶质细胞。
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