论文摘要
恶性黑素瘤（malignant melanoma，MM）简称恶黑，是一种高度恶性的肿瘤，常原发于皮肤及粘膜组织，可广泛浸润皮肤表皮至皮下组织或粘膜及粘膜深层组织，甚至相邻器官（或组织），并可通过淋巴结、血行远处转移，或广泛播散，发病率占皮肤恶性肿瘤的第三位（3％～5％），死亡率极高，其浸润、转移又是引起恶性黑素瘤患者死亡的主要原因，因此，对恶性黑素瘤浸润、转移机制的探讨已成为研究热点之一。癌细胞一个最基本的特点一浸润转移，而在此过程中必需突破由细胞外基质（extracellular matrix，ECM）和基底膜（basement membrane，BM）组成的屏障。该屏障主要由2种成分构成：（1）结构蛋白：包括胶原、层联蛋白、纤维结合蛋白和玻璃体结合素等；（2）糖氨聚糖：其主要成分是硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparin sulfate proteoglycans，HSPGs）。在过去的10多年中认为，结构蛋白的破坏是癌细胞侵袭、转移的关键步骤，研究大多集中在底物为结构蛋白的基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）、丝氨酸蛋白酶以及半胱氨酸蛋白酶上。现在认为，糖氨聚糖作为细胞外基质和基底膜的另一主要成分也可以封闭、阻滞癌细胞的移动，其降解也是细胞侵袭前所必须的。乙酰肝素酶（heparanase，Hpa）是新近克隆成功的酶，裂解连接于HSPGs核心分子上硫酸肝素的一类内切糖苷酶，是抗肿瘤的理想靶点。目前Hpa、MMP2（matrix metalloproteinase-2）和TIMP2（tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-2）单独或联合其他指标在皮肤恶性黑素瘤（cutaneous malignant melanoma，CMM）中的研究已有报道，但三者联合在CMM中表达的研究尚未见报道，MMP2和TIMP2在乙酰肝素酶反义寡核苷酸（heparanase antisense oligodeoxynucleotide，Hpa-ASODN）转染的裸鼠恶性黑素瘤移植瘤组织中表达的研究未见报道。为进一步探讨Hpa、MMP2和TIMP2蛋白的表达与恶性黑素瘤浸润、转移的关系；寻求早期检测恶性黑素瘤浸润、转移的指标及寻找抑制恶性黑素瘤浸润、转移的有效方法，本文采用免疫组织化学SP技术检测了30例CMM、30例黑素细胞痣及15例正常皮肤组织中Hpa、MMP2和TIMP2蛋白的表达情况；用Hpa-ASODN分组转染培养的A375细胞，分组注入裸鼠皮下，在裸鼠体内构建恶性黑素瘤移植瘤动物模型，采用免疫组织化学SP技术检测裸鼠恶性黑素瘤移植瘤组织中与Hpa作用相关的MMP2和TIMP2蛋白的表达情况。通过以上实验，试图阐明Hpa、MMP2和TIMP2蛋白的表达在恶性黑素瘤浸润、转移中的意义；Hpa-ASODN对MMP2和TIMP2的抑制作用。为进一步探讨恶性黑素瘤浸润、转移机制及其阻断治疗提供理论依据。第一部分乙酰肝素酶、MMP2和TIMP2蛋白在皮肤恶性黑素瘤、黑素细胞痣及正常皮肤组织中表达的研究材料与方法1．采用免疫组化SP技术对30例CMM组织、30例黑素细胞痣组织和15例正常皮肤组织中的Hpa、MMP2和TIMP2的蛋白表达进行检测。2．统计学处理：所有数据均经SPSS10.0软件进行统计分析。计数资料计算阳性率；阳性率之间的比较采用x2检验（chi-square）；检验水准α=0.05。结果1．Hpa的表达Hpa在CMM组、黑素细胞痣组及正常皮肤组中的阳性表达率分别为63.33％（19例／30例）、6.67％（2例／30例）和0（0例／15例），CMM组与黑素细胞痣组Hpa的阳性表达率比较有统计学意义（x2=21.172，P=0.000）；CMM组与正常皮肤组Hpa的阳性表达率比较有统计学意义（x2=27.805，P=0.000）。黑素细胞痣组Hpa与正常皮肤组Hpa的阳性表达率比较无统计学意义。2．MMP2的表达MMP2在CMM组、黑素细胞痣组及正常皮肤组中的阳性表达率分别为70.00％（21例／30例）、13.33％（4例／30例）和0（0例／15例），CMM组与黑素细胞痣组MMP2的阳性表达率比较有统计学意义（x2=19.817，P=0.000）；CMM组与正常皮肤组MMP2的阳性表达率比较有统计学意义（x2=19.688，P=0.000）。黑素细胞痣组与正常皮肤组MMP2的阳性表达率比较无统计学意义。3．TIMP2的表达TIMP2在CMM组、黑素细胞痣组及正常皮肤组中的阳性表达率分别为60.00％（18例／30例）、6.67％（2例／30例）和0（0例／15例），CMM组与黑素细胞痣组TIMP2的阳性表达率比较有统计学意义（x12=19.200，P=0.000）；CMM组与正常皮肤组TIMP2的阳性表达率比较有统计学意义（x22=15.000，P=0.000）。黑素细胞痣组与正常皮肤组TIMP2的阳性表达率比较无统计学意义。4．Hpa、MMP2和TIMP2相关性分析30例CMM蜡块，每例切3张片子，分别检测Hpa、MMP2和TIMP2的表达，均为阳性的共18例。其中，Hpa与MMP2相符率达90.48％（19／21），Hpa与TIMP2相符率达94.74％（18／19），MMP2于TIMP2相符率达85.71％（18／21）。经相关性分析，Hpa与MMP2正相关，r=0.860，P=0.000；Hpa与TIMP2正相关，r=0.932，P=0.000；MMP2及TIMP2正相关，r=0.802，P=0.000。第二部分MMP2和TIMP2蛋白在乙酰肝素酶反义寡核苷酸转染的裸鼠恶性黑素瘤移植瘤中表达的研究材料与方法1．应用阳离子脂质体介导技术，将1条Hpa-ASODN和1条N-ODN分别导入人恶性黑素瘤A375细胞，培养48h后，采用裸鼠左前腿背外侧皮下注射方式进行裸鼠体内成瘤实验，连续饲养7W。2．采用免疫组化SP技术观察乙酰肝素酶反义寡核苷酸（Hpa-ASODN）对裸鼠恶性黑素瘤移植瘤组织中MMP2和TIMP2蛋白表达的影响。3．所有数据均经SPSS10.0软件进行统计分析。计量资料用采用（?）±S表示；两组以上均数的比较用方差分析（ANVOA）。检验水准α=0.05。结果1．将经Hpa-ASODN转染的人恶性黑素瘤A375细胞体外分组培养后，注射入裸鼠体内，裸鼠均有肿瘤长出，成瘤时间一般在接种后7d～9d。2．3种不同浓度的Hpa-ASODN对裸鼠体内恶性黑素瘤移植瘤中MMP2和TIMP2蛋白表达表现出不同程度的抑制作用，30mmol／L实验组的抑制作用最强，与其余2个实验组两两相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。3．实验组中MMP2和TIMP2蛋白表达与N-ODN转染组、未经转染的空白对照组相应的指标两两相比，差异均有统计学意义（MMP2 P＜0.05；TIMP2P＜0.05）。结论1．Hpa和MMP2蛋白在CMM中的表达明显高于其在黑素细胞痣和正常皮肤中的表达；2．CMM中Hpa蛋白的表达与MMP2蛋白的表达呈正相关，提示Hpa和MMP2蛋白在CMM的浸润转移中相互促进、相互协同；3．TIMP2蛋白的表达同MMP2和Hpa蛋白的表达呈正相关，提示在CMM发生过程中TIMP2蛋白随着MMP2和Hpa蛋白的表达而表达；4．Hpa-ASODN对裸鼠体内恶性黑素瘤移植瘤中的MMP2和TIMP2蛋白的表达有显著抑制效应。