人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因克隆的研究

论文摘要

人参皂苷-α-鼠李糖苷酶能专—性的水解人参皂苷上的鼠李糖基,使人参皂苷Re转化为人参皂苷Rg1。本文主要针对微生物Absidia sp.G3g产人参皂苷-α-鼠李糖苷酶的基因克隆进行了研究。比较几种提取总RNA的方法后,建立了适合微生物Absidia sp.G3g的RNA提取方法,即改进TakaRaRNAisoReagent试剂盒的方法。提取到的RNA完整性很好,在琼脂糖凝胶图片上,可以清楚的看见5S、18S和28S亚基。根据测得的人参皂苷-α-鼠李糖苷酶蛋白N端序列设计引物,使用RT-PCR的方法扩增出CDS区的基因部分序列。再根据测定的CDS区的基因部分序列设计引物,使用RACE的方法扩增出微生物Absidia sp.G3g产人参皂苷-α-鼠李糖苷酶的基因的全序列。调取微生物Absidia sp.G3g产人参皂苷-α-鼠李糖苷酶的完整CDS区基因,产物纯化后pMD19-T载体连接,转化大肠杆菌JM109感受态细胞。酶切鉴定结果表明目的片段克隆成功。对基因的核酸序列进行了测定,在NCBI中对序列结果进行了同源性比较,发现它与目前已知的鼠李糖苷酶基因无同源性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 人参皂苷概述
• 1.1.1 人参皂苷的化学结构
• 1.1.2 人参皂苷的理化性质
• 1.1.3 人参皂苷的药理作用
• 1.1.4 人参皂苷结构改造
• 1.2 人参皂苷-α-鼠李糖苷酶
• 1.2.1 在酶学方面的研究
• 1.2.2 在分子生物学方面的研究
• 1.3 研究人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因的分子生物学方法
• 1.3.1 RNA的提取
• 1.3.2 使用PCR技术扩增基因
• 1.3.2.1 RT-PCR技术
• 1.3.2.2 RACE技术扩增未知基因末端
• 1.3.3 克隆技术
• 1.3.4 序列的测定与分析
• 1.4 本论文的主要研究内容
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料与工具
• 2.1.1 菌株与载体
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 实验仪器与设备
• 2.1.4 主要试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 液体发酵培养基成分的制备
• 2.2.1.1 麸皮浸出液的制备
• 2.2.1.2 人参浸出液的制备
• 2.2.2 菌株液体发酵条件确定
• 2.2.2.1 培养基中诱导物浓度的确定
• 2.2.2.2 发酵时间的确定
• 2.2.3 发酵产酶活性检测
• 2.2.3.1 接菌与培养
• 2.2.3.2 酶液提取与酶反应
• 2.2.3.3 酶活力检测
• 2.2.4 菌体收集
• 2.2.5 RNA的提取方法确定
• 2.2.5.1 LiCl法
• 2.2.5.2 异硫氰酸胍法
• 2.2.5.3 RNAiso Reagent改进法
• 2.2.6 RNA的质量的检测
• 2.2.6.1 吸光值检测
• 2.2.6.2 琼脂糖凝胶电泳检测
• 2.2.7 RNA的DNA Rase处理与精制
• 2.2.7.1 RNA的DNA Rase消化反应
• 2.2.7.2 RNA的精制
• 2.2.8 人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因全序列调取
• 2.2.8.1 CDS区基因部分序列的扩增
• 2.2.8.2 CDS区基因部分序列产物回收
• 2.2.8.3 使用RACE技术扩增基因3'和5'端的序列
• 2.2.9 人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因全序列的拼接与比对
• 2.2.10 人参皂苷-α-鼠李糖苷酶CDS区基因的克隆
• 2.2.10.1 人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因CDS区基因的获取
• 2.2.10.2 PCR产物和载体的连接
• 2.2.10.3 转化及重组子的筛选
• 2.2.10.4 重组质粒的提取
• 2.2.10.5 重组质粒DNA酶切检测
• 2.2.10.6 序列分析
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 人参皂苷-α-鼠李糖苷酶液体发酵条件的研究
• 3.1.1 液体发酵培养基最佳诱导物浓度的确定
• 3.1.2 发酵时间的研究
• 3.2 总RNA的提取
• 3.2.1 RNA提取方法的确定
• 3.2.1.1 LiCl法提取RNA结果检测
• 3.2.1.2 异硫氰酸胍法提取RNA结果检测
• 3.2.1.3 RNAiso Reagent试剂盒改进法提取RNA结果检测
• 3.2.2 RNA的纯化
• 3.2.3 RNA的纯度和完整性的检测
• 3.2.3.1 吸光值检测
• 3.2.3.2 琼脂糖凝胶电泳检测
• 3.3 基因序列的调取
• 3.3.1 CDS区基因部分序列的调取
• 3.3.1.1 引物的设计
• 3.3.1.2 引物的合成
• 3.3.1.3 扩增人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因
• 3.3.2 基因全序列的扩增
• 3.3.2.1 3'RACE产物检测
• 3.3.2.2 5’RACE产物检测
• 3.3.2.3 基因全长序列拼接和基因同源性比对
• 3.4 人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因CDS区扩增和克隆
• 3.4.1 引物设计
• 3.4.2 CDS区基因调取
• 3.4.3 基因片段上“A”处理
• 3.4.4 将目的片段与载体连接
• 3.4.5 重组质粒PCR检测
• 3.4.6 提取质粒检测
• 3.4.7 重组质粒的酶切鉴定
• 3.4.8 克隆后质粒的测序与分析
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录A
• 附录B