基于Col-I/PVA共聚纺丝技术构建支架型ACL

论文摘要

前交叉韧带（anterior cruciate ligament，ACL）是保持膝关节稳定的一条重要关节内韧带，它阻止胫骨前移，对膝关节的运动和稳定影响巨大。然而ACL损伤后几乎不能自行修复，这对关节稳定影响是巨大的，其后果包括伤后立即导致关节的不稳定及远期膝关节退变，从而严重影响膝关节关节运动，导致残障。尤其在骨性关节炎病人中,韧带损伤已经被证实是重要的早期诱因之一。现有的治疗主要为手术置换重建ACL，然而现有治疗方法均存在一定的缺陷。自体组织移植常常导致供区部位的并发症，且需要二次手术；异体组织移植存在传染疾病的风险，且存在免疫排斥问题。人工前交叉韧带重建ACL是近年来逐渐兴起的一种治疗方法，该手段无来源限制，无传染疾病风险。然而，现在临床上可用的商品化人工韧带多为永久性韧带，存在疲劳断裂的可能。由聚对苯二甲酸乙二醇酯（polyethylene terephthalate，PET）纤维制作的先进性韧带加强系统（ligament advanced reinforcement system，LARS）在近年的临床应用中显示了令人满意的结果，但LARS仍存在一些不足，例如缺乏长期随访研究等。组织工程技术的发展，为ACL的重建修复治疗提供了新的思路和技术。目前，国内外有众多学者从事人工韧带/组织工程韧带研究，并且已有多种高分子材料制作的组织工程韧带在实验室研究中显示出良好的生物相容性和物理性能。但仍存在一些问题，以致目前无修复重建效果好的人工前交叉韧带以及真正的组织工程韧带应用于临床治疗。现较为热门的组织工程韧带材料有：1、天然高分子材料如胶原、蚕丝等；2、人工合成高分子材料如聚乙醇酸（Polyglycolicacido,PGA）、聚乳酸（polylactic,PLA）、聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）等。这些高分子材料在实验室研究中均取得了一些较为满意的结果，但仍与临床应用的要求存在一定差距。究其原因主要有：1、材料的生物活性欠佳；2、.材料的生物相容性欠佳；3、新生组织与原组织接合欠佳；4.、材料的降解速度与组织再生速度不匹配；5、材料的力学性能有待提高等。综上所述，本研究依照材料仿生学原理，应用天然ACL细胞外基质主要成分I型胶原蛋白（Collagen I，Col-I）与聚乙烯醇（PVA）共聚后采用湿法纺丝技术制成纤维，构建支架型人工前交叉韧带。结合临床使用实际，本研究在不进行细胞体外种植的条件下进行了人工前交叉韧带置换重建。研究中发现，Col-I/PVA共聚纤维的力学性能满意，与PET纤维在最大载荷方面无显著性差异，弹性模量优于PET纤维；Col-I/PVA共聚纤维的体外降解试验显示其降解速度可满足新生组织的生长替代速度。Col-I/PVA共聚纤维浸提液MTT比色法、直接接触L-929细胞共培养及小鼠皮下植入短期（9W）实验，显示Col-I/PVA共聚纤维具有良好的生物相容性；在大动物实验中，Col-I/PVA共聚纤维构建的韧带可以起到早期功能重建的作用，在对新生组织进行组织学染色分析后显示新生组织、细胞形态与正常ACL组织、细胞类似；免疫组化染色示新生韧带I型胶原蛋白呈阳性，III型胶原蛋白呈弱阳性，tenascin-c呈阳性，提示新生组织为韧带组织；力学性能检测示新生韧带其最大载荷为472.43±15.20N,虽与正常ACL630.07±76.11N的最大载荷相比较具有差异，但已可以负荷日常的膝关节活动。第一部分Col-I/PVA共聚纤维的制备与体外降解、力学性能，生物相容性检测本部分研究为了更好的修复重建ACL，依据材料仿生原理，采用Col-I与PVA常温共聚湿法纺丝技术，制成Col-I/PVA共聚纤维；对Col-I/PVA共聚纤维的体外降解、力学性能进行相关检测。采用Col-I/PVA浸提液MTT比色法，Col-I/PVA共聚纤维与L-929细胞直接接触共培养法，皮下组织短期植入（9W），对Col-I/PVA共聚纤维进行生物相容性检测。一、实验方法1．25℃条件下，按照50：50的浓度配制成Col-I/PVA共聚纺丝原液，经过滤、脱泡后采用湿法制丝，以饱和硫酸钠溶液为凝固剂的凝固浴中在适当的牵引作用下制成Col-I/PVA共聚纤维[。（Col-I/PVA共聚纤维由四川乐山五通桥丰茂精细化工有限公司提供制作）2．Col-I/PVA共聚纤维相关理化性能检测（1）体外降解实验评价Col-I/PVA共聚纤维降解速度；（2）Col-I/PVA共聚纤维为实验组与PET纤维为对照组，进行相关力学测试；3．分为100%浓度Col-I/PVA共聚纤维浸提液、50%浓度Col-I/PVA共聚纤维浸提液、空白对照、阳性对照4个组，使用小鼠成纤维细胞（L-929），MTT比色法测定各组细胞在1、2、3、4、5、6、7d的吸光度值，计算细胞相对增殖率（relative growth rate,RGR），判定细胞毒性的级别；4．Col-I/PVA共聚纤维与L-929细胞直接接触共培养，倒置显微镜和扫描电镜观察细胞在Col-I/PVA共聚纤维上的生长、增殖情况；5．将Col-I/PVA共聚纤维和聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）纤维分别植入昆明小鼠背部皮下，术后第1周、第3周、第9周分别取标本大体观察，HE、Masson三色法进行组织学对比观察。二、实验结果1．通过湿法纺丝技术制成的Col-I/PVA共聚纤维为60但尼尔（Denier，D），纤维质地柔软，具有可编织性。2．通过体外降解实验，显示Col-I/PVA共聚纤维降解率为1W：8.28%，2W：15.14%，3W：16.26%，4W：16.88%，6W：17.17%，8W：17.44%。3．经力学测试，Col-I/PVA共聚纤维束：最大载荷：88.6433±0.69189N，抗拉强度：112.8667±0.88288Mpa，弹性模量：0.4667±0.04631Gpa，断裂伸长率：17.2733±1.41608%，断裂强度：56.51±13.54123Mpa；PET纤维束：最大载荷：96.1075±0.9393N，抗拉强度：151.07±1.47561Mpa，弹性模量：123.48±14.76304Gpa，组断裂伸长率：21.32±7.68921%，断裂强度：39.2125±5.18963Mpa。Col-1/PVA共聚纤维组与PET组在拉伸试验中除弹性模量p＜0.05具有显著性差异外，其余的各项参数p＞0.05，无显著性差异。4．MTT比色法：2个实验组（50%、100%浸提液组）细胞在不同时间点的相对增殖率为90%～123.61%，Col-I/PVA共聚纤维的细胞毒性评级为0～I级；5．直接接触共培养法：细胞与Col-I/PVA共聚纤维直接接触共培养4d，生长良好、形态呈梭型，较多细胞附着材料生长。6．皮下植入的Col-I/PVA共聚纤维和PET纤维在术后第1周、第3周、第9周均有包膜形成，随植入时间的延长，材料周围包膜透明度逐渐增高，包膜周围炎细胞主要为中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞，随时间的延长炎细胞数量明显减少。三、结论Col-I/PVA共聚纤维质地柔软，具有可编织性，降解速度及力学性能较好，符合支架型人工前交叉韧带的要求。Col-I/PVA共聚纤维的生物相容性良好，细胞毒性为01级，组织相容性良好，在临床应用的允许范围内。第二部分支架型人工ACL制备，大动物实验及新生韧带检测为了更好了解Col-I/PVA共聚纤维构建的支架型人工前交叉韧带的修复重建性能，本部分研究采用中国广西巴马小型猪，进行人工前交叉韧带置换重建，并对重建后的ACL大体解剖及主要细胞外基质的相对含量进行检测。一、实验方法1．支架型Col-I/PVA共聚纤维前交叉韧带的编织构建2．支架型Col-I/PVA共聚纤维前交叉韧带的拉伸测试3．大动物实验4．术后评价二、实验结果1．重建韧带的最大载荷及弹性模量与Col-I/PVA共聚纤维前交叉韧带无显著性差异，与广西巴马小型猪天然ACL较为接近。2．影像学观察：DR检查示人工前交叉韧带固定牢靠，螺钉位置好；CT薄层扫描示实验组骨隧道没有扩大并已有较为明显的钙化组织形成；MRI示人工前交叉韧带上已形成新生组织，影像学观察与正常PCL较为类似。3．大体观察：大体观察实验组ACL重建后未发现明显关节腔内积液及滑膜组织增生；固定用螺钉在位牢靠；在原ACL部位形成新生韧带组织，其形态、色泽基本同正常ACL（图3-20A）。空白对照组单纯切除ACL后未发现明显关节腔内积液、滑膜组织增生，ACL切除后无修复，原ACL附丽部被滑膜组织包裹。4．组织学染色、免疫组化染色分析：组织学分析后显示新生组织、细胞形态与正常ACL组织相类似；免疫组化染色示重建韧带I胶原蛋白及tenascin-c呈阳性，III型胶原蛋白呈弱阳性，提示新生组织为韧带组织。5．超微结构观察：扫描电镜观察见，大量纤维样新生组织生长并紧密附着于未降解的Col-Ⅰ/PVA共聚纤维；有大量卷曲样胶原纤维形成。三、结论通过支架型人工前交叉韧带修复重建ACL的大动物实验，术后24周观察、检测示：人工前交叉韧带可起到早期功能重建作用，重建的新生韧带中纤维细胞及ECM与正常ACL相类似，力学性能也与ACL相近。研究显示Col-I与PVA共聚纤维支架型人工前交叉韧带具有良好的应用前景。全文结论本研究中Col-I/PVA共聚纤维构建的支架型人工前交叉韧带，在材料上具有较高的仿生性，两种材料的共聚弥补了Col-I和PVA在力学性能及降解速度等方面各自的不足。Col-I/PVA共聚纤维的力学性能满意，与PET纤维在最大载荷等方面上无显著性差异；Col-I/PVA共聚纤维的体外降解试验显示其降解速度可满足新生组织的生长替代速度；通过细胞毒性实验及组织相容性实验，显示Col-I/PVA共聚纤维具有良好的生物相容性。通过大动物实验，Col-I/PVA共聚纤维构建的支架型人工前交叉韧带可以起到早期功能重建的作用；免疫组化染色示新生韧带I型胶原蛋白及tenascin-c呈阳性，III型胶原蛋白呈弱阳性，提示新生组织为韧带组织；拉伸实验显示重建韧带的力学性能接近广西巴马小型猪天然ACL。为了寻求更好重建、修复效果，在未来的研究中我们将对Col-I/PVA共聚纤维的配比和支架型ACL编织方法进行深入研究，以期望其具有更佳的修复重建性能。

论文目录

• 英文缩写一览表
• 英文摘要
• 中文摘要
• 前言
• 第一部分 COL-I/PVA 共聚纤维的制备与体外降解、力学性能，生物相容性检测
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第二部分 COL-I/PVA共聚纤维重建ACL可行性初探
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 全文总结
• 致谢
• 参考文献
• 文献综述 高分子材料在人工韧带中的应用
• 参考文献
• 攻读硕士研究生期间发表论文及申请专利情况