论文摘要
研究目的：1.探讨从兔下颌骨骨膜和骨髓分离的两种不同来源的间充质细胞在体外的生长特点和生物学功能的差异,为基因工程和组织工程筛选合适的种子细胞,为后续的实验研究奠定基础。2.探讨腺病毒介导的骨形态发生蛋白2（Ad-BMP-2）基因转染对体外培养的骨膜细胞和骨髓基质细胞的增殖以及向成骨细胞系分化的作用,观察目的基因在两种细胞内的表达情况,从而为基因治疗选择合适的靶细胞。3.探讨腺病毒介导的骨形态发生蛋白2（Ad-BMP-2）诱导兔下颌升支外侧骨膜异位成骨的作用机制。4.探讨多孔状生物活性玻璃陶瓷（BGC）与体外培养扩增的兔骨膜细胞的生物相容性,为骨组织工程载体材料的选择提供依据。5.探讨腺病毒介导的骨形态发生蛋白2（Ad-BMP-2）基因修饰的骨膜细胞与生物活性玻璃陶瓷复合修复兔下颌骨临界骨缺损的能力,并对基因修饰的组织工程化骨的作用机制进行初步探讨。研究方法：1.通过酶消化法分离培养骨膜细胞,密度梯度离心法分离骨髓基质细胞,体外对两种细胞分别进行培养扩增。在体外对两种细胞进行形态学观察、增殖能力测定、克隆形成能力测定、ALP定性定量检测以及体外矿化能力的检测；在体内,将两种细胞接种到自体背部肌袋内,6周后观察异位骨形成效果。2.利用人胚肾293细胞扩增腺病毒,空斑形成试验检测病毒滴度；将Ad-BMP-2转染骨膜细胞和骨髓基质细胞,原位杂交试验测定目的基因的表达,酶联免疫吸附试验（ELISA）测定转染细胞目的蛋白的表达,噻唑蓝比色法（MTT法）测定转染细胞的增殖能力,酶动力学法测定碱性磷酸酶（ALP）活性,并对结果进行统计学分析。3.18只成年新西兰大白兔按随机化原则分成3组,每组6只,在一侧下颌升支外侧骨膜处注射0.2ml Ad-BMP-2（共含病毒滴度2×109pfu）作为实验组,对侧注射等量的PBS作为对照组,术后2、5、10周分别处死1组动物,行大体观察、影像学和组织学检查,观察新骨形成的时间和空间变化特点。4.体外培养并扩增兔骨膜细胞,运用MTT法和酶学测定法分别检测BGC提取液对细胞增殖和碱性磷酸酶（ALP）活性的影响,运用倒置相差显微镜、扫描电镜观察与BGC复合培养的细胞在材料内的生长情况。5.将18只新西兰大白兔按随机化原则分成甲、乙两组,每组9只,在每只兔双侧下颌骨体部制作10mm×6mm的矩形骨缺损,按植入物的不同分为4小组。A组：植入Ad-BMP-2基因修饰的组织工程化骨（甲组右侧）；B组：植入未经基因修饰的组织工程化骨（甲组左侧）；C组：植入单纯BGC材料（乙组右侧）；D组：空白对照组（乙组左侧）,保留缺损,未植入任何材料。术后4、8、12周分别处死甲、乙两组3只动物,行大体观察、影像学和组织学检查,对各个时期的新骨形成的数量进行定量分析,并对结果进行统计学分析。结果：1.两种不同来源的间充质细胞在体外均表现为成纤维细胞样的外观。在同等条件下,骨膜细胞的增殖能力要高于骨髓基质细胞,但克隆形成率低于后者；骨膜细胞表达较高的ALP活性,骨髓基质细胞表达较低的ALP活性,前者是后者的3～4倍；在诱导培养液存在的条件下,在体外均能形成矿化结节,植入体内6周后均能分化形成骨样组织,前者以骨膜化骨为主,后者以软骨化骨为主。2.我们扩增的病毒滴度为5.5×1010pfu/ml；两种细胞的转染效率与病毒浓度有关,在感染复数为100时,转染率均达95%以上；转染第1d时即有目的蛋白的表达,在第5d时达到高峰,分别为3126.3±150.5pg/ml和3069.7±159pg/ml,在体外功能蛋白的表达至少持续2周；基因转染对细胞的增殖能力影响不大,甚至可以促进细胞的增殖；两种转染细胞分泌ALP的能力均明显提高,这种作用与病毒浓度成正相关关系,基因转染对骨髓基质细胞分泌ALP能力的影响高于对骨膜细胞的影响。3. Ad-BMP-2局部注射可以引起一定程度的炎症反应,这种反应随时间延长逐渐减弱；第2周时,注射区域的细胞开始增殖和分化,有较多成纤维细胞样细胞聚集；第5周时,类骨基质开始形成,部分区域开始矿化；第10周时,有编织骨和髓腔样结构形成。骨化程度在不同个体间存在差异,骨化方式早期包括软骨化骨和膜性化骨两种方式,晚期以膜性化骨为主。而注射PBS侧始终没有新骨形成。4.BGC提取液对培养早期细胞的增殖有一定的抑制作用,对培养晚期细胞的增殖无明显影响,在细胞培养过程中能上调骨膜细胞分泌ALP的能力；细胞在BGC材料孔隙表面生长增殖良好,并能分泌细胞外基质。5.术后各组动物均生长良好,各实验组均未出现急性免疫排斥反应。影像学显示：第4周,A、B、C三个实验组的移植材料与周围骨组织均开始融合,边界模糊。第8周,A组植入材料密度与周围骨组织相近,交界线基本消失,B、C组密度略低。第12周,各实验组与周围骨组织完全融合,但材料密度仍以A组高。对照组始终存在骨缺损。组织学检查结果：从第4周开始,A、B、C三组材料周边空隙内均有较多的新骨形成,随移植时间延长,新骨量增多,矿化程度增高,在各个时间点,A组形成的新骨均高于B组（P<0.05）和C组（P<0.01）；而材料内部,A、B两组均有新生骨组织形成,新生骨量相似（P>0.05）,明显高于C组（P<0.05）。对于D组,缺损周边有少量的新骨形成,大部分区域为纤维结缔组织,12周时仍遗留明显骨性缺损。结论：1.两种不同来源的间充质细胞具有相似的细胞形态,但生物学功能存在差异,在适宜的刺激因素下均能向成骨细胞系分化,提示下颌骨骨膜细胞也可以作为组织工程的良好的种子细胞来源之一。2.两种转染细胞均可以高效的表达目的基因和目的蛋白,Ad-BMP-2基因转染可以促进细胞向成骨细胞系的分化,骨膜细胞和骨髓基质细胞均可以作为腺病毒载体转染的良好的靶细胞。3.一定浓度的Ad-BMP-2可以诱导下颌升支外侧骨膜和肌肉内的异位骨形成,增加皮质骨的厚度。4.在体外多孔状BGC具有良好的细胞相容性,可以作为细胞载体应用于骨组织工程领域的研究。5. Ad-BMP-2基因修饰的骨膜细胞可以做为骨组织工程的种子细胞,基因修饰的组织工程化骨具有更好的成骨潜能,可以更有效地修复骨缺损。
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