论文摘要
心肌梗塞后，存活的心肌细胞数量减少，纤维疤痕组织增生，心功能下降，最终发展为缺血性心力衰竭甚至死亡。目前临床所用的治疗手段不能逆转已坏死的心肌，心脏移植由于费用和排斥反应等问题不能得到推广应用。因此，寻找一种新的、更好的治疗手段已成为当务之急。大量的研究人员把研究重点放到了干细胞的移植治疗上，而干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞两大类。其中胚胎干细胞由于取材困难等因素的限制，成体干细胞逐渐成为人们研究的重点。骨髓间充质干细胞（MSCs）是成体干细胞的一种，来源于中胚层的间充质。在一定的环境和刺激因子的作用下可分化为多种组织细胞，在组织工程中，MSCs作为一种重要的种子细胞越来越引起人们的关注，将MSCs诱导分化为心肌细胞移植治疗心肌梗塞，为中药与干细胞联合治疗心血管疾病提供新的理论依据。MSCs属于非造血细胞，其特点是贴壁生长，呈纺锤型的纤维细胞样，国内外研究认为MSCs具有独特的表征和巨大的培养增殖能力，并认为其是多向分化潜能的干细胞，在一定条件下可以分化为骨骼、软骨、肌肉、神经和造血微环境组织等，具有很高的可塑性。国内外学者在体外培养中将MSCs经传代后用5-氮胞苷（5-aza）对其进行诱导分化，可见有心肌细胞样超微结构，有心肌特异性基因表达，并有持续的动作电位，表明他们成功地诱导出心肌细胞。另有研究人员将MSCs直接注射入自体心肌组织内，发现有心肌样细胞形成，具有肌钙蛋白T和肌球蛋白重链染色阳性的心肌细胞特异性标志，表明MSCs在体内微环境条件下可以诱导分化为心肌细胞。MSCs作为一种重要的种子细胞越来越引起人们的关注，研究者把研究重点放在如何对其进行诱导分化为心肌细胞，以期为移植治疗心梗提供新的理论依据。用于MSCs体外诱导分化为心肌细胞的诱导剂主要是化学物质5-Aza，但5-Aza有一定的毒性，关于中药诱导的报道较少，这可能与干细胞诱导分化研究涉及的技术问题较多，中药介入的条件还不太成熟有关。寻求一种高效安全的诱导剂是干细胞诱导分化研究的关键。淫羊藿是补肾壮阳类中药，常用于治疗阳虚证，淫羊藿苷（ICA）是其主要活性成分，ICA药理活性主要表现在改善心血管系统功能、增强机体免疫力、促进DNA合成及诱导肿瘤细胞分化等方面。在改善心脑血管系统功能方面，其主要功效为补肾强心、宁心安神、养血除烦。对改善冠心病患者心绞痛等症状及缺血型心电图有较好疗效，并有镇静和降血脂作用。在对该成分体外定向诱导ES细胞分化成心肌细胞的研究中发现：ICA与ES细胞的定向分化呈一定的量效、时效关系。我们考虑ICA是否也与MSCs的定向分化呈一定的量效、时效关系。该诱导分化是否也能促进MSCs在体内对梗死心肌的修复作用。本课题研究希望通过检测ICA诱导MSCs后的α-MHC、β-MHC等基因的表达，以及Desmin、cTnT、VEGF和BFGF的表达，来探讨ICA是否能诱导MSCs分化为心肌细胞，其最佳的诱导浓度和诱导时间是多少；在体内实验研究中，诱导后的细胞是否能有效改善心梗大鼠的受损心肌，为研究心梗的治疗提供新的研究思路。目的探讨淫羊藿苷体外诱导MSCs分化为心肌样细胞的最佳时效和量效关系，并以此为基础，进一步探讨诱导后的MSCs移植治疗心梗大鼠的心肌修复。方法本课题分为四个实验进行实验一、按照不同的药物浓度将ICA分为10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M五个浓度梯度，利用MTT法检测不同浓度组对MSCs的增殖影响。同时通过形态学和免疫组化对分离所得的细胞进行表型分子鉴定。实验二、利用RT-PCR对ICA各浓度组(10-6M、10-7M、10-8M、10-9M)诱导MSCs后，心肌细胞特有的α-MHC、β-MHC和GATA-4的表达情况，探讨ICA诱导MSCs表达心肌细胞特有的α-MHC、β-MHC和GATA-4的时效、量效关系。同时以5-Aza为阳性对照。实验三、在实验二的基础上进一步探讨诱导后的MSCs分泌VEGF和BFGF的表达情况，同样以5-Aza为阳性对照。实验四、在实验二和实验三的基础上，把ICA体外诱导后的MSCs经尾静脉注射入大鼠体内2W和4W，通过免疫组化检测心梗部位心肌Desmin、cTnT、VEGF和BFGF的表达情况，同时通过HE染色和Masson染色观察该治疗方法对受损心肌的修复情况。结果实验一、采用无菌分离大鼠胫、股骨骨髓腔细胞，并用全贴壁培养法所获得的细胞经传代培养，去掉其中的造血细胞，得到的是骨髓间充质干细胞。与空白对照组比较，10-7M、10-8M的ICA与MSCs共培养48h后，能明显促进MSCs的增殖，P<0．01。实验二、ICA体外促进MSCs分泌α-MHC、β-MHC的最佳浓度是10-7M，最佳的诱导时间是共培养24h后，换成完全培养基培养1W。实验三、再次确认ICA体外促进MSCs分泌VEGF和BFGF的最佳浓度是10-7M，最佳的诱导时间是共培养24h后，换成完全培养基培养1W。实验四、把经ICA最佳浓度和时间诱导后的MSCs移植入心梗大鼠体内后，与移植治疗2W组比较，4W组能明显促进Desmin、VEGF和BFGF的表达，梗塞部位心肌纤维化程度减轻，有一定数量的新生血管形成，对梗塞心肌的修复作用明显。结论由实验一至实验三可知：①10-7M和10-8M的ICA在体外能促进MSCs增殖；②10-7M和10-8M的ICA能有效促进MSCs心肌发育依赖的α-MHC、β-MHCmRNA的表达，而诱导24h后再换液培养1周是其最佳的诱导时间。③10-6M和10-7M的ICA能显著促进细胞分泌VEGF、bFGF表达。综合以上实验结果，我们认为：ICA体外诱导MSCs分化为心肌样细胞的最佳浓度是10-7M，最佳诱导时间是诱导24h后再换液培养1周。在体外实验结果的基础上对MSCs进行诱导，再把诱导后的细胞通过尾静脉注射输入心梗大鼠体内，实验发现：把经10-7M的ICA诱导24h再换液培养1周的MSCs经尾静脉移植，能有效地修复受损心肌，促进该部位Desmin、cTnT、VEGF和BFGF的表达。已有大量的实验研究针对骨髓间充质干细胞（MSCs）移植治疗心梗，较多的研究人员提出：将MSCs通过一定的途径移植到心梗大鼠体内能有效地修复受损心肌。而在本实验中，我们却发现：MSCs没有预先经过一定的处理而直接进行移植治疗，Desmin、cTnT、VEGF和BFGF的表达相对较弱，仅比不做任何治疗的模型组稍好；而经过与ICA共培养后再进行移植，其修复效果理想，Desmin、cTnT、VEGF和BFGF的表达强，效果满意。综上所述，ICA能促进体外分离的MSCs增殖；还能促进MSCs的α-MHC、β-MHCmRNA的表达；对VEGF和BFGF的分泌同样有促进作用；通过尾静脉注射移植诱导后的MSCs细胞，能修复受损心肌，促进心肌修复所需的Desmin、cTnT、VEGF和BFGF的表达。因此，由本课题研究我们认为：10-7M的ICA与MSCs共培养24h后，在更换为完全培养基培养1周，能诱导MSCs分化为心肌样细胞，经其诱导后的细胞能有效改善心梗后的受损心肌。
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标签：骨髓间充质干细胞论文; 淫羊藿论文; 分化论文; 心肌样细胞论文;