诱导子对丹参毛状根生长和丹参酮含量的影响

论文摘要

中药丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）的干燥根和根茎,是我国常用的中药之一。近几年,随着丹参药理功效研究的不断深入,对丹参次生代谢物的研究成为新的热点。丹参的有效成分在原植物中含量低,并且生长周期长,在传统的栽培模式下又面临着质量参差不齐、品质严重退化等问题。如何获得有效成分含量高,品质稳定的丹参资源是丹参药材进军国际市场的一大挑战。毛状根由于具有自身特点而成为研究丹参有效成分的良好试验材料,但随后研究发现,利用毛状根生产的次生代谢产物产量仍然比较低,影响着培养的进一步扩大和工业化。目前在毛状根已有的研究结果中表明诱导已成为提高毛状根中次生代谢产物产量的有效方法。本文考查了不同种类的诱导子—红花链格孢菌（Alternaria carthami）（链格孢属）、瓜枝孢菌（Cladosporium cladosporioides）（枝孢菌属）、聚乙二醇（PEG）和脱落酸（ABA）不同浓度以及不同处理时间对丹参毛状根生长、4种丹参酮（二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA）合成的诱导效果。以期找到能有效提高丹参酮生产的诱导子及其最优诱导条件,为进一步的生产放大和研究做好准备。在丹参毛状根的培养过程中发现,毛状根在6,7-V培养基中生长较好,而在MS（有NH4N03）培养基中长势较差,但有效成分含量较高。于是本论文还研究了6,7-V和MS培养基不同营养元素对丹参毛状根生长及丹参酮类成分积累的影响,旨在寻找培养基中影响丹参毛状根生长和丹参酮类成分积累的营养元素,进而为培养基的改良提供参考。1.丹参毛状根培养基中的大量元素显著影响着毛状根的生长和有效成分的积累;减少MS培养基的大量元素MgSO4·7H2O的含量,可以促进毛状根的生长和丹参酮ⅡA的释放;而大量元素中含量过多的NH4N03则不利于丹参毛状根的生长,同时也不利于丹参酮类成分的积累和释放。在后续的诱导实验中,培养丹参毛状根的液体培养基就采用了液体MS（无NH4N03）培养基。2.不同浓度的两种真菌诱导子（红花链格孢菌、瓜枝孢菌）在毛状根生长和丹参酮类成分积累这两方面,较低浓度的诱导子比较高浓度的诱导子有相对更好的诱导效果。不同浓度的两种真菌诱导子均促进了毛状根的生长,总体来说对毛状根的干重影响不大。两种诱导子一般都能有效地提高丹参酮的产量,不同诱导子的诱导效果之间存在差别。50μg/mL的红花链格孢菌诱导子可以获得毛状根中最高的二氢丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA产量,分别是对照的3.16和1.25倍;毛状根中最高的隐丹参酮和丹参酮ⅡA的产量由250μg/mL的瓜枝孢菌诱导子获得,分别是对照产量的5.24和1.43倍。从而确定红花链格孢菌诱导子和瓜枝孢菌诱导子的诱导浓度分别为50μg/mL,250μg/mL加入培养基中。3.两种真菌诱导子加入后对丹参毛状根的生长及丹参酮合成动态影响结果如下:两种真菌诱导子随着诱导时间的延长,不仅毛状根的生长量逐渐增大,毛状根和培养基中的不同丹参酮还可以被选择性地诱导提高,并且都在第6天达到最大值。而且瓜枝孢菌诱导处理对毛状根和培养基中的丹参酮类成分的促进作用均优于红花链格孢菌诱导处理的。两个诱导子都显著提高了隐丹参酮的产量。4.不同浓度的两种非生物诱导子ABA和PEG均显著抑制了丹参毛状根的生长,而对于毛状根中4种丹参酮类成分的积累却有不同程度的促进作用;随着诱导浓度的增加,4种丹参酮含量均表现出先增加后降低的趋势,而且较低浓度的诱导子比较高浓度的有相对更好的诱导效果。ABA和PEG两种非生物诱导子促进丹参毛状根丹参酮积累的最佳浓度分别为200μmol/L,2%。5.诱导的第1天,ABA和PEG诱导子均抑制了毛状根的生长,直至诱导的第6天,ABA和PEG诱导子均促进了毛状根的生长。ABA和PEG诱导子对丹参酮类成分的积累总体上表现出了一定的促进效果。4种丹参酮类成分的积累在ABA诱导后迅速上升,而且随着诱导时间的延长逐渐增加,均在第6天达到最高。其中ABA诱导的隐丹参酮和丹参酮ⅡA的含量在每个收获期,与对照相比,均得以极显著提高。PEG诱导子对丹参酮类成分的积累作用规律不一致,二氢丹参酮Ⅰ和隐丹参酮的含量在PEG诱导后,呈现先增加后降低的趋势,均在第2天达到最大值。丹参酮Ⅰ的积累量波动上升,每个收获期,与对照相比,均得以极显著提高。丹参酮ⅡA的含量在PEG诱导的第1天开始就持续上升,每个收获期的积累量,与对照相比,均得以极显著提高。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 综述
• 1.1 丹参
• 1.1.1 丹参的主要化学成分
• 1.1.2 丹参的药理作用
• 1.1.3 丹参的组织培养
• 1.2 毛状根
• 1.2.1 毛状根的诱导
• 1.2.2 毛状根的特性
• 1.2.3 影响毛状根生长及次生代谢产物产生的因素
• 1.2.4 毛状根培养技术的应用前景
• 1.3 诱导子技术
• 1.3.1 诱导子的定义和分类
• 1.3.2 诱导子的作用机制
• 1.3.3 诱导子的作用特点
• 1.3.4 诱导子在毛状根培养中的应用
• 1.4 本研究的目的和意义
• 第二章 6,7-V 和MS 培养基不同营养元素对丹参毛状根生长及丹参酮积累的研究
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 丹参毛状根的培养
• 2.2.2 培养丹参毛状根的两种培养基
• 2.2.3 试验方法
• 2.2.4 毛状根鲜重和干重的测定
• 2.2.5 丹参毛状根和培养基中丹参酮含量的提取和测定
• 2.2.6 丹参酮类成分含量的测定
• 2.3 结果分析
• 2.3.1 培养基中的不同元素（大量、微量和有机元素）对丹参毛状根生长的影响
• 2.3.2 培养基中的不同元素（大量、微量和有机元素）对毛状根中丹参酮类成分的影响
• 2.3.3 培养基中的不同元素（大量、微量和有机元素）对培养基中丹参酮类成分的影响
• 2.3.4 培养基中的大量元素各组分对丹参毛状根生长的影响
• 2.3.5 培养基中的大量元素各组分对毛状根中丹参酮类成分积累的影响
• 2.3.6 培养基中的大量元素各组分对培养基中丹参酮类成分释放的影响
• 2.4 讨论
• 第三章 真菌诱导子对丹参毛状根生长和合成丹参酮的影响
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 丹参毛状根的培养
• 3.2.2 真菌诱导子的制备
• 3.2.3 毛状根鲜重和干重的测定
• 3.2.4 丹参毛状根和培养基中丹参酮含量的提取和测定
• 3.2.5 诱导试验方案
• 3.2.6 丹参酮类成分含量的测定
• 3.3 结果分析
• 3.3.1 不同浓度的真菌诱导子对丹参毛状根生长的影响
• 3.3.2 不同浓度的真菌诱导子对毛状根中丹参酮类成分积累的影响
• 3.3.3 不同浓度的真菌诱导子对培养基中丹参酮类成分释放的影响
• 3.3.4 真菌诱导子的处理时间对丹参毛状根生长的影响
• 3.3.5 真菌诱导子的处理时间对毛状根中丹参酮类成分积累的影响
• 3.3.6 真菌诱导子的处理时间对培养基中丹参酮类成分释放的影响
• 3.4 讨论
• 第四章 ABA 和PEG 诱导子对丹参毛状根生长和合成丹参酮的影响
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 丹参毛状根的培养
• 4.2.2 诱导子的制备
• 4.2.3 毛状根鲜重和干重的测定
• 4.2.4 丹参毛状根和培养基中丹参酮含量的提取和测定
• 4.2.5 诱导试验方案
• 4.2.6 丹参酮类成分含量的测定
• 4.3 结果分析
• 4.3.1 不同浓度的ABA 和PEG 诱导子对丹参毛状根生长的影响
• 4.3.2 不同浓度的ABA 和PEG 诱导子对毛状根中丹参酮类成分积累的影响
• 4.3.3 ABA 和PEG 诱导子的处理时间对丹参毛状根生长的影响
• 4.3.4 ABA 和PEG 诱导子的处理时间对毛状根中丹参酮类成分积累的影响
• 4.4 讨论
• 第五章 结论与讨论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介