鸡Gal-11和Gal-12基因的克隆、表达及活性检测

论文摘要

B-防御素是鸡体内最重要的抗菌肽,除了具有直接的杀菌、抗病毒作用外,它还参与机体免疫反应,有重大的开发利用潜力。本文构建了表达鸡B-防御素-11和β-防御素-12（Gal-11和Gal-12）的大肠杆菌表达系统,研究了重组鸡β-防御素在大肠杆菌系统中高水平表达规律和蛋白纯化技术,为其进一步研究开发奠定了基础。本研究共分四部分:①鸡Gal-11基因cDNA的克隆根据genebank中AY621326序列设计了一对引物,运用RT-PCR技术,从固始鸡L系-崇仁麻鸡肾脏总RNA中扩增出片断大小为315bp的鸡Gal-11编码cDNA序列全长。测序结果与AY621326比对,同源性达99%。②鸡Gal-12成熟肽DNA的克隆根据genebank中AY621327设计上下游引物,从基因组DNA中扩增出大小为159bp的目的片断测序结果EF044309与序列AY621327,AY534898和DQ858309比对,序列完全一致;③鸡Gal-11和Gal-12基因的原核表达以pET32a为表达质粒构建了重组质粒pET32a-Gal-11和pET32a-Gal-12,并在BL21（DE3）pLySs中进行融合表达。SDS-PAGE电泳结果表明在目标位置约27.175KD和22.896KD出现条带。诱导剂IPTG在0.2mM-1.2mM的对重组蛋白的产量无明显影响,加入诱导剂1h开始有可检出量重组蛋白质的表达,在2h时其表达水平已接近最大量。④鸡Gal-11和Gal-12基因表达产物的活性检测融合表达蛋白经过初步分离,变性,组氨酸亲和层析柱纯化,复性,对纯化的表达蛋白进行琼脂糖弥散试验检测生物学活性。结果表明:蛋白进行抑菌试验对大肠杆菌、白色念球菌、金黄色葡萄球菌没有产生抗菌活性。鸡Gal-11和Gal-12在pET32a质粒表达体系中成功表达为鸡防御素多肽下一步的研究奠定基础。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 抗菌肽
• 1.1.1 抗菌肽的分类
• 1.1.2 抗菌肽的活性及其作用机理
• 1.1.3 抗菌肽应用前景
• 1.2 防御素
• 1.2.1 防御素的发现及其分类
• 1.2.2 防御素的生物学活性
• 1.2.3 防御素的作用机理
• 1.2.4 β-防御素的分子生物学特征
• 2 引言
• 3 鸡Gal-11基因编码cDNA的克隆
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 鸡总RNA的提取
• 3.1.2.2 RT-PCR引物的设计与合成
• 3.1.2.3 鸡Gal-11 cDNA的合成
• 3.1.2.4 PCR产物的回收和纯化
• 3.1.2.5 PCR产物与T载体的连接
• 3.1.2.6 重组质粒的转化及转化菌的筛选
• 3.1.2.7 菌液PCR鉴定
• 3.1.2.8 小量重组质粒的提取
• 3.1.2.9 重组质粒的鉴定
• 3.1.2.10 重组质粒DNA测序
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 从鸡肾脏、输卵管和肝脏组织提取的RNA鉴定结果
• 3.2.2 RT-PCR结果
• 3.2.3 重组质粒pUCmT-Gal-11的鉴定
• 3.2.4 鸡Gal-11碱基序列比对
• 3.2.5 鸡Gal-11核苷酸同源性分析
• 3.2.6 鸡Gal-11氨基酸序列比对
• 3.2.7 鸡Gal-11氨基酸同源性分析
• 3.3 结论与讨论
• 3.3.1 鸡β-防御素的研究现状
• 3.3.2 目的组织的选择
• 3.3.3 总RNA的提取
• 3.3.4 引物的设计和RT-PCR扩增
• 3.3.5 Gal-11基因的序列与结构分析
• 4 固始鸡Gal-12基因成熟肽基因的克隆
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.1.2.1 鸡血液基因组DNA的提取
• 4.1.2.2 PCR引物的设计与合成
• 4.1.2.3 鸡Gai-12 cDNA的合成
• 4.1.2.4 PCR产物的回收和纯化
• 4.1.2.5 PCR产物与T载体的连接
• 4.1.2.6 重组质粒的转化及转化菌的筛选
• 4.1.2.7 菌液PCR鉴定
• 4.1.2.8 小量重组质粒的提取
• 4.1.2.9 重组质粒的鉴定
• 4.1.2.10 重组质粒DNA测序
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 从鸡血液中提取的基因组DNA鉴定结果
• 4.2.2 PCR结果
• 4.2.3 重组质粒pUCmT-Gal-12的鉴定
• 4.2.4 鸡Gal-12碱基序列比对
• 4.2.5 鸡Gal-12氨基酸序列比对
• 4.2.6 鸡Gal-12碱基同源性分析
• 4.2.7 鸡Gal-12氨基酸同源性分析
• 4.3 结论与讨论
• 4.3.1 Gal-12基因的结构特点
• 4.3.2 基因组DNA的提取
• 4.3.3 引物的设计和PCR扩增
• 4.3.4 Gal-11基因的序列与结构分析
• 5 固始鸡Gal-11和Gal-12基因在大肠杆菌中的表达
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.1.2.1 目的片段的制备
• 5.1.2.2 表达质粒的构建
• 5.1.2.3 重组表达质粒和表达工程菌的构建
• 5.1.2.4 测序鉴定
• 5.1.2.5 重组质粒的诱导表达
• 5.1.2.6 融合蛋白表达形式分析
• 5.1.2.7 诱导表达对宿主菌的影响
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 pET32a-Gal-11和pET32a-Gal-12重组表达质粒的鉴定
• 5.2.2 重组质粒的诱导表达结果
• 5.2.3 融合蛋白表达形式分析
• 5.2.4 诱导表达对宿主菌的影响
• 5.3 结论与讨论
• 5.3.1 大肠杆菌表达系统的选择
• 5.3.2 载体和宿主菌株的选择
• 5.3.3 诱导表达条件的优化
• 5.3.4 重组蛋白的定位分析
• 6 固始鸡Gal-11和Gal-12表达产物的纯化及活性检测
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 方法
• 6.1.2.1 表达菌制备
• 6.1.2.2 细胞提取物制备
• 6.1.2.3 可溶性重组蛋白的纯化
• 6.1.2.4 重组蛋白包涵体的纯化
• 6.1.2.5 包涵体的复性
• 6.1.2.6 重组蛋白的活性检测
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 Gal-11蛋白纯化结果
• 6.2.2 Gal-12蛋白纯化结果
• 6.2.3 重组蛋白的活性检测结果
• 6.3 结论与讨论
• 6.3.1 β-防御素在大肠杆菌中表达的研究现状
• 6.3.2 重组蛋白的纯化
• 6.3.3 重组蛋白pET32a-Gal-12的复性
• 6.3.4 重组蛋白的活性检测
• 参考文献
• ABSTRACT