大豆黄烷酮-3-羟化酶基因（f3h）RNA干扰型载体的构建及功能验证

论文摘要

类黄酮是植物生长过程中生成的一类次生代谢产物,包括异黄酮、黄酮、查耳酮、花青素等具有生物活性的物质。类黄酮代谢途径的研究对提高食品的功能性成分和植物的防御反应具有重要的作用。本研究采用RNAi技术原理构建大豆黄烷酮-3-羟化酶基因（f3h）RNA干扰型植物表达载体,用发根农杆菌转化大豆子叶外植体,干扰类黄酮代谢途径中黄烷酮-3-羟化酶基因,定量PCR检测f3h基因表达水平,用HPLC来分析f3h基因干扰后类黄酮物质含量的变化情况。得到主要结果如下:1)根据NCBI数据库中的大豆黄烷酮-3-羟化酶基因（f3h）的cDNA序列（GeneBank:AF198451）,选取其中的303bp的片段来构建干扰载体,其位置在起始密码子下游的695-997bp之间。2)本研究构建的f3h基因RNAi表达载体pHANNIBAL-F3h-RNAi以载体pHANNIBAL为基本骨架,表达载体功能区由CaMV35S启动子引导,正义片段和反义片段之间由PDK内含子隔开,终止子是章鱼碱合成酶（OCS）的终止序列。3)本研究构建的f3h基因RNAi植物表达载体P1304+-F3h-RNAi以载体pCAMBIA1304+PBI121为基本骨架,含有载体pHANNIBAL-F3h-RNAi上f3h基因RNAi功能区所有结构,并含有一个gus基因表达盒。4)将f3h基因RNAi植物表达载体P1304+-F3h-RNAi、载体pCAMBIA1304+PBI121通过发根农杆菌ATCC15834介导,转化大豆子叶,获得转化毛状根。5)定量PCR功能验证结果表明,f3h基因RNAi植物表达载体转化生成的毛状根中,f3h基因的表达受到显著抑制,表达量与对照相比降低90%以上。6)HPLC分析结果显示, f3h基因RNAi植物表达载体转化生成的毛状根中,黄豆甙元、黄酮的含量与对照相比明显提高。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 大豆类黄酮的研究
• 1.1.1 类黄酮的结构与作用
• 1.1.2 大豆异黄酮生物合成途径
• 1.1.3 f3h 的研究
• 1.2 RNAi 的研究
• 1.2.1 RNAi 的发现
• 1.2.2 RNAi 的原理
• 1.2.3 RNAi 在植物基因工程中的应用
• 1.2.3.1 植物基因功能的研究
• 1.2.3.2 植物抗逆方面的研究
• 1.2.3.3 植物的品质改良
• 1.2.4 RNAi 植物表达载体的构建
• 1.2.4.1 载体结构的选择
• 1.2.4.2 目的基因片段的选择
• 1.3 毛状根的研究进展与应用
• 1.3.1 发根农杆菌与Ri 质粒
• 1.3.2 发根农杆菌转化机制
• 1.3.3 毛状根的应用
• 1.3.3.1 用毛状根生产次生代谢产物
• 1.3.3.2 毛状根培养技术在理论研究中的应用
• 1.3.3.3 毛状根再生获得转基因植物和培育作物新品种
• 1.4 本课题研究的目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料和试剂
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 质粒和菌种
• 2.1.3 实验试剂
• 2.1.4 培养基和溶液配方
• 2.1.5 PCR 扩增所用引物列表
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 植物总RNA 的提取（TRIzol 法）及检测
• 2.2.2 cDNA 的合成
• 2.2.3 目的片段的克隆PCR 反应
• 2.2.4 目的片段的电泳回收
• 2.2.4.1 从琼脂糖凝胶中回收DNA
• 2.2.4.2 从溶液中回收DNA
• 2.2.5 载体pMD18-T vector 和目的DNA 片断的连接
• 2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
• 2.2.6.1 大肠杆菌感受态细胞的制备（CaC12 法）
• 2.2.6.2 转化大肠杆菌感受态细胞（热激法）
• 2.2.7 质粒DNA 的提取
• 2.2.7.1 质粒的少量提取与鉴定（碱法）
• 2.2.7.2 质粒的大量提取
• 2.2.8 f3h RNAi 植物表达载体（P1304+-F3h-RNAi）的构建
• 2.2.8.1 pHANNIBAL-F3h 的构建
• 2.2.8.2 pHANNIBAL-F3h-RNAi 的构建
• 2.2.8.3 P1304+-F3h-RNAi 的构建
• 2.2.9 植物表达载体导入农杆菌
• 2.2.9.1 农杆菌感受态细胞的制备（CaC12 法）
• 2.2.9.2 植物表达载体导入感受态农杆菌（冻融法）
• 2.2.10 发根农杆菌诱导大豆毛状根的生成
• 2.2.10.1 种子消毒和萌发（合丰47）
• 2.2.10.2 农杆菌的预培养
• 2.2.10.3 农杆菌侵染
• 2.2.10.4 农杆菌的去除
• 2.2.11 植物基因组DNA 提取
• 2.2.12 毛状根PCR 检测
• 2.2.13 定量PCR 分析
• 2.2.13.1 半定量PCR
• 2.2.13.2 Real Time PCR 分析
• 2.2.14 HPLC 测定毛状根中类黄酮含量
• 第三章 结果与分析
• 3.1 植物不同组织总RNA 的提取
• 3.2 目的基因克隆
• 3.3 f3h 基因RNAi 植物表达载体的构建
• 3.3.1 pHANNIBAL-F3h-RNAi 的构建
• 3.3.2 P1304+-F3h-RNAi 的构建
• 3.4 植物表达载体导入农杆菌
• 3.5 毛状根的生成情况分析
• 3.6 毛状根的PCR 检测
• 3.7 定量PCR 分析
• 3.7.1 半定量PCR
• 3.7.2 Real Time PCR 反应分析
• 3.8 HPLC 分析毛状根中类黄酮的含量变化
• 第四章 讨论
• 4.1 RNAi 植物表达载体的构建
• 4.2 发根农杆菌介导的植物转化
• 4.3 转化毛状根的分析
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 上海交通大学硕士学位论文答辩决议书